Questo protocollo può distinguere chiaramente le modalità di morte delle cellule macrofagi durante l'infezione micobatterica. Osservando più embrioni in parallelo, aumenta notevolmente la probabilità di catturare l'intero processo di morte delle cellule llitiche macrofagi. Questo protocollo può anche essere applicato all'osservazione della morte cellulare e di altri comportamenti cellulari in scenari simili che coinvolgono infezione o infiammazione sterile.
Durante l'imaging live esteso, è molto importante mantenere l'intensità del laser il più bassa possibile per evitare fotobleaching e tossicità. Dopo l'inoculazione secondo il manoscritto, centrifuga la coltura a 3000 volte G per 10 minuti per raccogliere il Mycobacterium marinum come pellet. Scartare tutti i microlitri tranne 300 del supernatante e sospendere di nuovo il pellet.
Aggiungere tre millilitri di mezzo 7H9 con 10%glicerolo per sospendere ulteriormente il pellet, quindi sonicare la sospensione in un bagno d'acqua a 100 watt, con 15 secondi di su e 15 secondi di riposo, per un totale di due minuti per ottenere un omogeneato a singola cella. Trasferire la sospensione batterica in una siringa da 10 millilitri e passare attraverso un filtro da cinque micron per rimuovere eventuali grumi batterici. Utilizzando uno spettrofotometro, misurare la densità ottica della sospensione e diluirla con mezzi 7H9 contenenti 10%glicerolo a OD 600 in una sola.
Dividere la sospensione in aliquote da 10 microliter e conservare a -80 gradi Celsius congelatore per un ulteriore utilizzo. In primo luogo, riscaldare l'agarosio in un blocco riscaldante di 95 gradi Celsius fino a quando non è completamente fuso. Mantenere l'agarosio in forma liquida posizionandolo in un blocco riscaldante di 45 gradi Celsius.
Per montare per l'infezione intramuscolare nella regione del tronco, creare lo strato inferiore di agarosio versando 0,5 millilitri dell'1% di peso in volume agarosio uniformemente su uno scivolo di vetro. Posizionare lo scivolo su una ghiacciaia o su una superficie fredda per tre minuti per solidificarsi. Dopo aver anestetizzato gli embrioni di zebrafish, posizionare fino a 60 embrioni di zebrafish sullo strato inferiore di agarosio e stenderli accuratamente in due file.
Rimuovere l'acqua rimanente sullo strato di agarosio inferiore con carta velina, prima di aggiungere 0,3 millilitri dello 0,5% di peso in volume di agarosio per creare lo strato superiore. Assicurarsi che gli embrioni siano completamente incorporati nell'agarosio. Riportare di nuovo lo scivolo di vetro nella ghiacciaia per solidificare l'agarosio.
Mantenere umido lo strato superiore dell'agarosio coprendo la superficie con acqua uovo E3 extra. Quindi, regolare il microiniettore e il micromanipolatore nella posizione e nell'impostazione corrette per la microiniezione. Trasferire tre microlitri di coltura batterica preparata nell'ago preparato utilizzando un microloader.
Pipetta lentamente e con attenzione per evitare di formare bolle d'aria. Iniettare 100 CFU nella regione del tronco. Dopo la microiniezione, sciacquare accuratamente gli embrioni di pesce zebra in acqua fresca all'uovo con una pipetta di plastica.
Per montare per l'infezione da midbrain, utilizzare una pipetta di plastica per trasferire gli embrioni anestetizzati da quattro a sei nell'agarosio. Posizionare la testa di ogni embrione verso l'alto con attenzione con un ago calibro 10. Una volta fissate tutte le posizioni degli embrioni, trasferire lo scivolo di vetro in una ghiacciaia o in una superficie fredda per far solidificare l'agarosio.
Iniettare 500 CFU nel cervello medio. Dopo la microiniezione, sciacquare accuratamente gli embrioni di zebrafish in acqua fresca all'uovo con una pipetta di plastica. Una volta che l'agarosio si è completamente solidificato, coprire l'agarosio con uno strato di acqua d'uovo.
Dopo aver istituito la camera ambientale, posizionare il piatto inferiore in vetro da 35 millimetri con il pesce zebra nella camera ambientale. Aprire il diodo 405, l'argon al 20% di potenza e il laser DPSS da 561 nanometri. Impostare la potenza laser appropriata nelle impostazioni dello spettro.
Scegliere la modalità di acquisizione della scansione sequenziale XYZ e impostare il formato delle immagini su 512 per 512 pixel. Passa alla modalità dati in tempo reale, indirizza la posizione del primo zebrafish e segna la posizione Z iniziale e finale. Ripetere questo processo per ciascuno degli embrioni rimanenti.
Aggiungere una pausa alla fine del programma. Definire il ciclo e il ciclo del programma e salvare il file. In questo studio, abbiamo utilizzato coro1a transgenico precedentemente riportato:eGFP;lyzDsRed2 e mpeg1loxP transgenico;DsRed:loxPeGFP;lyz:eGFP, per distinguere i macrofagi e i neutrofili in vivo.
Un macrofago fortemente ingoiato da batteri divenne rotondo e mostrava una ridotta motilità, con un eventuale gonfiore citoplasmatico, rupturing della membrana cellulare e una rapida diffusione del contenuto citoplasmatico. I macrofagi irradiati dai raggi UV mostravano tipici fenotipi di cellule apoptotiche come il restringimento cellulare, la frammentazione nucleare e la condensazione della cromatina. È stato anche osservato che i macrofagi hanno attivamente phagocytosed e diffuso M.merinum.
Tuttavia, i neutrofili avevano una limitata capacità fagocitica e subirono rapidamente la morte cellulare litica senza evidente ingorgemento batterico. Combinato con potenti strumenti di editing genico, questo protocollo può fornire una piattaforma efficace per comprendere ulteriormente l'effetto di una varietà di fattori sull'interazione ospite-patogeno in vivo.
