Vorremmo ringraziare Alison Philbrook, Belinda Barbagallo e Michael Francis per i commenti perspicaci su questo documento. La ricerca riportata in questa pubblicazione è stato sostenuto da un premio R15 AREA 1R15NS070172-01A1 assegnato a MLL.

1 Coverslip Preparazione: lavaggio acido e Bake <ol><li> Almeno 2 giorni prima della dissezione (punto 2), iniziare la seguente procedura per preparare vetrini. Eseguire la fase di lavaggio acido per rimuovere oli e coprioggetto accuratamente puliti. </li><li> Coprioggetto carico di titolare di porcellana che posiziona verticalmente coprioggetto e impedisce loro di toccarsi. Immergere porta e coprioggetto in un contenitore di vetro riempito con istologia 2 M di acido cloridrico (HCl). In alternativa, se titolare di porcellana non è disponibile, si sviluppa ~ 20 coprioggetto orizzontalmente per coprire il fondo di 100 mm vetro piastra di Petri e immergere coprioggetto in 2 M HCl. </li><li> Collocare recipiente di vetro (con coprioggetto sommerse in acido) sulla tabella rocker in cappa e permettere dolce dondolo per almeno 5 ore a temperatura ambiente. In alternativa, lavaggio acido coprioggetto durante la notte nelle stesse condizioni. </li><li> Lavare coprioggetto con H 2 O distillata (dH 2 O) trasferendo titolare porcellana caricatocon coprioggetto da 2 M HCl a un contenitore di istologia di vetro pulito riempito con dH 2 O. In alternativa, decantare 2 M HCl da vetro piatto di Petri con coprioggetto e riempire con dH 2 O. </li><li> Lavare per decantazione nuovo dH 2 O e ricarica vaso di vetro con fresca dH 2 O. Ripetere per un totale di 3 lavaggi rapidi. </li><li> Inizia regime di lavaggio più restituendo recipiente di vetro (con coprioggetto e dH 2 O) sul bilanciere. Lasciare per agitazione per 10-30 minuti a temperatura ambiente. Poi, decantare dH 2 O e aggiungere dH fresco 2 O. Ripetere per un totale di almeno dieci lavaggi. In alternativa, continuare il lavaggio durante la notte. </li><li> Mettere coprioggetto lavati in forno preriscaldato a 350 ° C. Se si utilizza supporto di porcellana, rimuovere il supporto da dH 2 O contenitore di vetro riempito e poi posto supporto con coprioggetti direttamente nel forno. Se si utilizza una capsula di Petri di vetro, decantare dH 2 O e posizionare il piatto di vetro con lamelle in furnace. </li><li> Cuocere lamelle per almeno cinque ore o durante la notte a 350 ° C. </li><li> Dopo la cottura, rimuovere coprioggetto dal supporto di porcellana con pinza sottile e riporre in sterile 100 millimetri di vetro piatto di Petri. Lascia coprioggetto che non sono stati originariamente inseriti nel supporto di porcellana nella scatola di Petri di vetro. </li></ol> 2. Chick Dissezione e isolamento dei DRG <ol><li> Rimuovere fertile, messo in scena Bianco Livorno pulcino uovo da incubatrice (tenutasi a 37-38,5 ° C con dolce dondolio). NOTA: Studi precedenti hanno utilizzato il giorno embrionale 7-10 per l&#39;isolamento di DRG 2,8,11-13,16. </li><li> Mettere l&#39;uovo selezionato in cappa a flusso laminare. Condurre tutte le procedure elencate di seguito in condizioni asettiche in cappa a flusso laminare con soluzioni e strumenti sterili. Pre-caldo tutte le soluzioni in un bagno di 37 ° C Acque. </li><li> Crack uovo e posizionare il contenuto in un 100 millimetri piastra di Petri di plastica. Utilizzare pinze standard per il trasferimento di embrioni in un altro piatto di Petri a 100 mm. </li><li&gt; Usando una pipetta Pasteur, aggiungere riscaldato 1x PBS per piastra di Petri per mantenere il tessuto umido. Decapitare embrione pizzicando collo con una pinza sottile. Trasferimento corpo ad un altro pulito 100 millimetri piastra di Petri. </li><li> Aggiungi F12HS10 caldo (F12 di Ham, HEPES 10 mM, 100 unità / ml di penicillina, 0,1 mg / 10% di siero fetale bovino ml streptomicina,) per Piatto con pipetta Pasteur per mantenere il tessuto umido. Utilizzare pinze per posizionare embrione sul suo lato dorsale (Figura 1A). </li><li> Mettere 100 millimetri in plastica piastra di Petri contenente tessuto embrionale su un microscopio da dissezione stereovisione binoculare in cappa a flusso laminare. Utilizzare una pinza sottile per fare una incisione verticale mediana dalla coda alla nuca pizzicando il derma in via di sviluppo per esporre il cuore, polmoni e altri organi. In alternativa, fare una serie di piccoli strappi per esporre gli organi interni. </li><li> Utilizzano delicatamente 2 set di sterili pinza sottile a: a) cogliere il collo e b) cogliere l&#39;aorta o di altri tessuti immediatamente superiore al cuore e tirare verso la coda,sviscerare l&#39;animale. </li><li> Applicare F12HS10 caldo con pipetta Pasteur al tessuto. Usare pinze per rimuovere eventuali cardiovascolari, organi respiratori o digestivi rimanenti per esporre le costole in via di sviluppo, la colonna vertebrale e DRG (Figure 1B-1D). </li><li> Sotto il microscopio da dissezione, utilizzare una pinza sottile per rimuovere ulteriormente gli organi e raccogliere DRG lungo entrambi i lati della colonna vertebrale lombare, inferiore alle costole. Raccogliere DRG pizzicando DRG intatti dall&#39;embrione. Afferrare e recidere le radici che arrivano dalla DRG verso il midollo spinale e afferrare il nervo in via di sviluppo che arriva dal DRG verso la periferia o viceversa. </li><li> Mettere DRG intatti in un piatto di cultura 35 millimetri pieno di F12HS10 caldo. Rimuovere qualsiasi tessuto in eccesso, come la dorsale o delle radici ventrali che possono aver aderito a DRG, dai DRG intatte in piastra da 35 mm da pizzicare con una pinza sottile. </li><li> Per ottenere DRG superiori alla regione lombare, rimuovere la metà ventrale del torace e Cervical colonna vertebrale. Ciò avviene effettuando un taglio sulla colonna vertebrale sviluppo perpendicolare all&#39;asse del midollo spinale nella regione cervicale superiore e un altro taglio nella regione lombare superiore. Quindi, fare tagli paralleli all&#39;asse del midollo spinale lungo il lato destro e sinistro della colonna vertebrale. Sollevare la parte ventrale della colonna vertebrale dall&#39;embrione, che espone i espone il midollo spinale (Figure 1E-1F). </li><li> Per consentire un facile accesso ai DRG, rimuovere il midollo spinale toracico e cervicale afferrando il midollo spinale con una pinza sottile. Utilizzare le pinze per sollevare il midollo spinale dalla colonna vertebrale. In prima approssimazione, il midollo spinale toracico è a livello di nervature e la zona cervicale è superiore alle costole. </li><li> Raccogliere toracica intatta e DRG cervicali con una pinza sottile e metterli in F12HS10 caldo con altri DRG. Rimuovere il tessuto in eccesso che possono aderire a DRG. </li><li> Risciacquare interno di una nuova pipetta Pasteur di vetro con F12HS10 per aiutareimpedire DRG di attaccarsi alle pareti della pipetta. Utilizzare la pipetta sciacquati per trasferire tutti i DRG e F12HS10 dalla piccola scatola di Petri in un tubo da 15 ml sterile e procedere immediatamente al punto 3. NOTA: Ulteriori embrioni possono essere sezionati per aumentare il numero di DRG. DRG devono essere tenuti in F12HS10 a 37 ° C fino al momento per il passo 3. </li></ol> 3 Dissociazione, Arricchimento, e Coltura DRG neuroni - Parte 1 <ol><li> Luogo tubo conico con DRG intatti in centrifuga e delicatamente girare (200 xg) per 2-3 minuti. Verificare che DRG hanno affondato al fondo della provetta. In caso contrario, far girare nuovamente. </li><li> Utilizzando una pipetta, rimuovere delicatamente F12HS10, lasciando DRG pellet indisturbati. Aggiungere 2 ml di 1x calcio e magnesio libero (CMF) PBS, staccare il pellet di DRG. Spin di nuovo e rimuovere CMF PBS lasciando intatto il pellet DRG. Ripetere questa operazione di lavaggio per un totale di tre lavaggi per rimuovere siero fetale bovino in F12HS10, che potrebbero interferire con la digestione tripsina in fase successiva. </li><li> Aggiungere 2 ml di tripsina riscaldato a tubo da 15 ml contenente 2 ml di PBS CMF e DRG. Collocare il tubo nel 37 ° C bagnomaria per 10-15 minuti a digerire DRG in cellule dissociate. </li><li> Durante l&#39;incubazione, far F12H + supplemento contenente i media (F12 di Ham, 10 mM HEPES 100 unità / ml di penicillina, 0,1 mg / ml di streptomicina, 10 ng / ml NT3, 10 ng / ml NGF, 200 mm L-glutammina e N2) e caldo a 37 ° C bagnomaria. Tipicamente, 10 ml di media totale è sufficiente per 4-5 35 millimetri piatti di neuroni sensoriali primari. Anche cominciare scongelamento laminina-1 per coprioggetto rivestimento (punto 4). </li><li> DRG delicatamente triturare in soluzione di tripsina con p1000 pipetta ed ispezionare visivamente l&#39;assenza di DRG intatti. Continuare triturazione fino DRG intatti non sono più visti da occhi e / o consentire più a lungo di incubazione tripsina a 37 ° C fino a bagnomaria DRG intatti sono dissociate. Per proteggere i neuroni DRG da danni, evitare bolle d&#39;aria durante la triturazione e limitare tripsina digestione a &lt;30 min. </li><li> Centrifuge provetta contenente DRG dissociate e tripsina a 200 xg per 3-5 minuti per formare pellet. Spin più a lungo se necessario fino a quando si forma pellet. </li><li> Attenzione aspirare tripsina senza interrompere pellet. Aggiungere 2 ml di F12HS10 a pellet. Triturare delicatamente DRG con una punta p1000 pipetta. </li><li> Trasferire tutti i contenuti di tubo da 15 ml in 100 mm piatto di cultura. Sciacquare il tubo con 8 ml F12HS10 e trasferirlo al piatto cultura, 2 ml alla volta per un totale di 10 ml. Questo passaggio risciacquo aiuta raccogliere cellule che possono essere rimaste aderito alle pareti del tubo. </li><li> Mettere 100 mm piatto cultura (10 ml F12HS10 e dissociato cellule DRG) in un umidificata 37 ° C incubatore per 3 ore. NOTA: CO 2 non è richiesto in incubatrice perché HEPES tampona il pH dei media, in assenza di CO 2. Durante l&#39;incubazione, le cellule gliali si legano alla superficie del tessuto della cultura plastica e neuroni tendono ad aderire liberamente a letto gliale. </li></ol> 4 Acid Washed rivestimentoe vetrini al forno con laminina-1 <ol><li> Scongelare aliquote sterili di laminina-1 congelato sul ghiaccio. </li><li> In condizioni sterili, aggiungere 1 ml di PBS sterile 1x a 50 ml un&#39;aliquota di laminina-1. </li><li> Utilizzare uno spettrofotometro per ottenere un valore di assorbanza di laminina-1 a 280 nm. Utilizzare questo valore nella seguente equazione per determinare la concentrazione di laminina-1. </li></ol> ABS 280 = (concentrazione mg / ml) * (coefficiente di estinzione di proteina) Il coefficiente di estinzione per laminina-1 è 0.86. <ol start="4"><li> In condizioni sterili, diluire laminina-1 con PBS 1X per ottenere le concentrazioni di 1 mg / ml e 20 mg / ml. Utilizzare questi due concentrazioni di laminina-1 applicati per ottenere una differenza di dieci volte della laminina-1 legata alla coprioggetto (30 ng / cm 2 e 300 ng / cm 2, rispettivamente) dopo incubazione 7,8,10. </li><li> In una cappa a flusso laminare, utilizzare una pinza sottile per posizionare una lavata con acido e al forno coverslip nel fondo di una piastra da 35 mm coltura. Ripetere se necessario per ottenere il numero di piatti necessari. </li><li> Sottoporre i coprioggetti a luce UV per 20-30 minuti al fine di garantire ulteriormente la sterilizzazione. Tenere il coperchio piatto durante questa fase. </li><li> Aggiungere 400 ml di laminina-1 preparato per ogni vetrino coprioggetto. Utilizzare la punta della pipetta per diffondere laminina-1 per garantire la piena copertura dei coprioggetto. Tensione superficiale consentirà laminina-1 per rimanere sul coprioggetto e si diffonde sul fondo del piatto di cultura, che è richiesto. </li><li> Mettere il coperchio sul piatto e lasciare laminina-1 a incubare per 2-3 ore a temperatura ambiente (3 ore è ottimale). </li><li> Dopo laminina-1 di incubazione, lavare coprioggetto utilizzando la tecnica asettica con PBS sterile in cappa a flusso laminare. Rimuovere soluzione sul coprioggetto e aggiungere 400 ml di PBS. Attendere 5-10 min. Ripetere per un totale di 3 risciacqui. </li><li> Lascia PBS sul coprioggetto dopo l&#39;ultimo risciacquo. Non rompere la tensione superficiale durante il risciacquo e non consentono coprioggetto si asciughino. Lecoperchio ave fino pronto al piatto neuroni dissociato sul coverlip. </li></ol> 5. Dissociazione, Arricchimento, e Coltura DRG neuroni - Parte 2 <ol><li> Dopo l&#39;incubazione, utilizzare una pipetta 10 ml sterile per sciacquare delicatamente la parte inferiore del piatto 100 millimetri contenente cellule DRG dissociate. Tenere piatto a ~ 45 °, tirare ~ 7 ml di F12HS10 con aiuti pipetta, poi delicatamente espellere 7 ml su circa un terzo del piatto. Ripetere 5x, rimuovendo delicatamente i neuroni. </li><li> Ruotare piatto e ripetere il risciacquo procedura, per altri sei risciacqui, su un altro terzo del piatto. Ripetere la procedura per il restante terzo di nuovo di piatto. In questo modo, sciacquare delicatamente l&#39;intero fondo del piatto con F12HS10 per rimuovere i neuroni. </li><li> Utilizzando stessa pipetta, trasferire F12HS10 contenente neuroni da mm piatto 100 a 15 tubo conico. Centrifugare per 5-10 min a 200 g per far sedimentare le cellule. </li><li> Rimuovere F12HS10, lasciando pellet indisturbati. Risospendere il pellet con 2 ml di F12H + supplementi riscaldato. </li><li&gt; Utilizzare un emocitometro per determinare la densità delle cellule. </li><li> Diluire le cellule, se necessario con integratori F12H + per determinare la concentrazione plating desiderato (120.000 cellule / ml per vetrini rivestiti con / ml laminina-1 e 40.000 cellule 1 mcg / ml per coprioggetto rivestiti con 20 mcg / ml laminina-1 8,16). </li><li> Rimuovere PBS da coprioggetto laminina rivestite e collocare immediatamente 400 ml di cellule su vetrini. Trasferire accuratamente piatto per un umidificata, 37 ° C coltura cellulare incubatore. Lasciare incubare per almeno 1 ora e fino a 3 ore per consentire i neuroni di aderire alla laminina-1. </li><li> In condizioni sterili, inondare delicatamente 35 millimetri piatti contenenti neuroni con 1,6 ml di F12H + supplementi. NOTA: In questo momento, la tensione superficiale sul coprioggetto può essere rotto. I neuroni sono adeguatamente rispettate laminina-1 sul coprioggetto. </li><li> Cellule Torna a incubatore e incubare una notte. Eseguire esperimenti, quali immunocitochimica il giorno successivo. </li></ol> 6.mmunocytochemistry <ol><li> Prima di immunocitochimica, soluzione fissativa caldo (4% paraformaldeide, il 30% di saccarosio 2X PBS) a 37 ° C bagnomaria. NOTA: Prima di fissare le cellule, trattare con i vari reagenti, come netrina-1, Mn 2 +, sonic hedgehog, semaphorin, e ephrin 16,29-31. </li><li> Rimuovere lentamente 1 ml di 2 ml di F12H + supplementi da piatto di cultura. Delicatamente aggiungere 1 ml di soluzione fissativa riscaldato. Lasciare incubare a temperatura ambiente per 10-15 minuti. </li><li> Rimuovere con cautela la soluzione fissativa e aggiungere 2 ml di PBS. Applicare la soluzione verso il bordo del piatto, evitando possibili sloggiare delle cellule fisso a seguito di applicazione di PBS. Incubare a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Ripetere lavaggio PBS per un totale di 5 lavaggi. Non permettere che le cellule si asciughino durante qualsiasi fase di immunocitochimica. </li><li> Rimuovere PBS. Applicare 1 ml di soluzione bloccante (0,1% Triton-X, 1X PBS, siero di capra normale 5%). Incubare per 1 ora a temperatura ambiente. In alternativa, a macchia molecole di superficie, Non utilizzare Triton-X nel bloccare soluzione 8. </li><li> Diluire gli anticorpi primari nella soluzione bloccante per la raccomandazione del produttore. Utilizzare 1: 500 per anticorpi contro NCAM e attivato β1 integrine 16. Rimuovere la soluzione bloccante, aggiungere 1 ml di soluzione di anticorpo primario e incubare per 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C. </li><li> Rimuovere la soluzione anticorpo primario e aggiungere 2 ml di PBS 1X. Incubare per 5-10 minuti a temperatura ambiente. Ripetere per un totale di 4 lavaggi PBS. Lava può essere esteso, se necessario. </li><li> Diluire l&#39;anticorpo secondario 1: 1.000 nel bloccare soluzione. Rimuovere PBS, aggiungere 1 ml di soluzione di anticorpo secondario e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. NOTA: Gli anticorpi secondari sono sensibili alla luce. Mantenere soluzioni e cellule nel buio più possibile da questo punto in avanti. </li><li> Rimuovere la soluzione anticorpo secondario e risciacquare 5x con 1x PBS, come fatto in precedenza. </li><li> Applicare ~ 60-80 ml di FluoromountG su un vetrino da microscopio. Utilizzando una pinza sottile, sollevare delicatamente il vetrino coprioggetto da piatto e basso coprioggetto in Fluoromount G su vetrino da microscopio. Evitare le bolle d&#39;aria. </li><li> Conservare scorre orizzontalmente a 4 ° C al buio. Dopo 12-24 ore, Fluormount G si polimerizza e coprioggetto sarà saldamente attaccato al vetrino da microscopio. Celle di immagine dopo questa fase di polimerizzazione è completa. </li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nervous+system-derived+chondroitin+sulfate+proteoglycans+regulate+growth+cone+morphology+and+inhibit+neurite+outgrowth:+A+light,+epifluorescence,+and+electron+microscopy+study.">Nervous system-derived chondroitin sulfate proteoglycans regulate growth cone morphology and inhibit neurite outgrowth: A light, epifluorescence, and electron microscopy study.</a> Microsc Res Tech. 54, 273-286 (2001).</li><li>Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological,+morphological,+and+electrophysiological+variation+among+retinal+ganglion+cells+purified+by+panning.">Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning.</a> Neuron. 1, 791-803 (1988).</li><li>Firnhaber, C., Hammarlund, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-specific+feeding+RNAi+in+C.+elegans+and+its+use+in+a+screen+for+essential+genes+required+for+GABA+neuron+function.">Neuron-specific feeding RNAi in C. elegans and its use in a screen for essential genes required for GABA neuron function.</a> PLoS genetics. 9, e1003921 (2013).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+1951.">A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 195, 231-272 (1992).</li><li>Hollyday, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+wing+innervation.+I.+Time+course+of+innervation+and+early+differentiation+of+the+peripheral+nerve+pattern.">Chick wing innervation. I. Time course of innervation and early differentiation of the peripheral nerve pattern.</a> The Journal of comparative neurology. 357, 242-253 (1995).</li><li>Hollyday, M., Morgan-Carr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+wing+innervation.+II.+Morphology+of+motor+and+sensory+axons+and+their+growth+cones+during+early+development.">Chick wing innervation. II. Morphology of motor and sensory axons and their growth cones during early development.</a> The Journal of comparative neurology. 357, 254-271 (1995).</li><li>Honig, M. G., Kueter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+cell+adhesion+molecules+on+the+growth+cones+of+chick+cutaneous+and+muscle+sensory+neurons.">The expression of cell adhesion molecules on the growth cones of chick cutaneous and muscle sensory neurons.</a> Developmental biology. 167, 563-583 (1995).</li><li>Tosney, K. W., Landmesser, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+major+pathways+for+neurite+outgrowth+in+the+chick+hindlimb.">Development of the major pathways for neurite outgrowth in the chick hindlimb.</a> Developmental biology. 109, 193-214 (1985).</li><li>Dontchev, V. D., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+growth+factor+and+semaphorin+3A+signaling+pathways+interact+in+regulating+sensory+neuronal+growth+cone+motility.">Nerve growth factor and semaphorin 3A signaling pathways interact in regulating sensory neuronal growth cone motility.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 6659-6669 (2002).</li><li>Munoz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ephrin-A5+inhibits+growth+of+embryonic+sensory+neurons.">Ephrin-A5 inhibits growth of embryonic sensory neurons.</a> Developmental biology. 283, 397-408 (2005).</li><li>Roche, F. K., Marsick, B. M., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+in+distal+axons+is+not+required+for+growth+cone+responses+to+guidance+cues.">Protein synthesis in distal axons is not required for growth cone responses to guidance cues.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 638-652 (2009).</li><li>Condic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neuronal+regeneration+induced+by+transgenic+integrin+expression.">Adult neuronal regeneration induced by transgenic integrin expression.</a> Journal of Neuroscience. 21, 4782-4788 (2001).</li><li>Hory-Lee, F., Russell, M., Lindsay, R. M., Frank, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin+3+supports+the+survival+of+developing+muscle+sensory+neurons+in+culture.">Neurotrophin 3 supports the survival of developing muscle sensory neurons in culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2613-2617 (1993).</li><li>Toyofuku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FARP2+triggers+signals+for+Sema3A-mediated+axonal+repulsion.">FARP2 triggers signals for Sema3A-mediated axonal repulsion.</a> Nature neuroscience. 8, 1712-1719 (2005).</li><li>Steinmetz, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+enhancement+of+the+intrinsic+growth+capacity+of+sensory+neurons+combined+with+the+degradation+of+inhibitory+proteoglycans+allows+functional+regeneration+of+sensory+axons+through+the+dorsal+root+entry+zone+in+the+mammalian+spinal+cord.">Chronic enhancement of the intrinsic growth capacity of sensory neurons combined with the degradation of inhibitory proteoglycans allows functional regeneration of sensory axons through the dorsal root entry zone in the mammalian spinal cord.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 8066-8076 (2005).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui vi presentiamo protocolli dettagliati per l&#39;isolamento e la coltura dissociati neuroni sensoriali provenienti da un embrione di pulcino. Questa procedura genera una popolazione arricchita di neuroni robusta crescita in vitro 7,8,10,16. Numerose tecniche cellulari e molecolari possono essere applicati a questi neuroni in coltura, compreso immunocitochimica, descritto qui. Questo protocollo è stato recentemente utilizzato per valutare quantitativamente l&#39;intensità delle integrine attivate...

I neuroni sono cellule complesse che portano le informazioni essenziali per una varietà di funzioni, tra cui la sensazione, visione, movimento del motore, l&#39;apprendimento e la memoria. Unico da altri tipi di cellule, i neuroni si estendono i processi braccio-come, chiamate assoni, per formare autostrade neurali essenziali per la comunicazione. Durante lo sviluppo specializzata vani situati alle estremità degli assoni in crescita, chiamati coni di crescita, navigare attraverso un concerto di segnali extracellulari per condurre l&#39;assone alla sua destinazione appropriata. I meccanismi molecolari complessi che sono alla base della crescita del cono di navigazione non sono pienamente compresi. Per comprendere meglio questi meccanismi, i ricercatori hanno utilizzato modelli di coltura cellulare per studiare i neuroni in vitro un ambiente definito e semplificato. Studiare i neuroni in coltura 1 ha portato a significativi progressi nella nostra comprensione della biologia delle cellule neuronali tra cui: la differenziazione neuronale 2, la dinamica del citoscheletro, endocitosi e traffico, dendriteregolazione 3,4, la rigenerazione assonale 5, e delle condizioni cliniche, come neuropatie 6. Inoltre, i neuroni in coltura sono altamente suscettibili di una vasta gamma di tecniche di ricerca tra cui immunocitochimica, cellulare superficie co-immunoprecipitazione, Western blot, trasfezione, RNAi, e l&#39;imaging dal vivo come l&#39;analisi Timelapse del cono di crescita motilità. Così, coltura neuroni primari è un approccio potente per chiarire numerosi aspetti della biologia cellulare dei neuroni. Il modello di coltura cellulare fornisce investigatori con un controllo dettagliato sulle condizioni ambientali e variabili. Ad esempio, il substrato su cui sono placcati neuroni (e crescono su) può essere facilmente manipolato. Qui, forniamo istruzioni dettagliate per la generazione di due substrati distinti, uno con una bassa concentrazione laminina-1 e l&#39;altro con saturazione concentrazioni di laminina-1. Sorprendentemente, concentrazioni diverse di una stessa molecola può avere effetti drammaticisullo stato interno dei neuroni e la loro composizione superficie cellulare. Ad esempio, i livelli intracellulari di cAMP e superficiali livelli di integrine sono significativamente differenti nei neuroni placcato su questi due substrati 7,8. Ulteriori studi hanno dimostrato che altre molecole, comprese fibronectina e proteoglicani condroitin solfato, impatto l&#39;espressione di molecole di superficie cellulare e motilità neuronale 7-11. Inoltre, molecole solubili quali neurotrofine e neurotropins concernono anche la composizione della membrana cellulare e motilità neuronale 12-16 e può essere facilmente e accuratamente manipolata in un modello di coltura cellulare. Qui, descriviamo i metodi per isolare e cultura dissociate neuroni sensoriali provenienti da embrioni di pollo. Questa procedura è stata utilizzata per fare progressi significativi nella neurobiologia, tra cui l&#39;estensione assonale 5,7,8,10,11,16-21 ed è stato modificato da una procedura volta a isolare le cellule gangliari 22. Ci sonodiversi vantaggi di questo approccio. In primo luogo, molte caratteristiche del pulcino ganglio della radice dorsale (DRG) sviluppo sono ben caratterizzati compreso il periodo di tempo per la nascita, l&#39;estensione assonale, e profili di espressione proteica 2,23-28, fornendo così una base istruttivo su cui costruire informativo in esperimenti in vitro. In secondo luogo, dissociate colture neuronali consentono al ricercatore di studiare più direttamente i neuroni rispetto ad approcci alternativi utilizzando espianti intatti DRG (che contengono i neuroni e le cellule non neuronali) e / o colture miste contenenti sia i neuroni dissociati e le cellule non neuronali. In terzo luogo, la procedura qui descritta è semplice, poco costoso e suscettibile di studenti. Pertanto, questa tecnica può essere utilizzata per la ricerca e per scopi didattici. Inoltre, le variazioni minori di questo protocollo dovrebbe permettere di purificazione veloce, ad alto rendimento di neuroni da fonti diverse DRG. Ad esempio, questa procedura può essere modificata per fornire neuronally enrculture iched da altri tessuti come il prosencefalo embrionale o del midollo spinale. Protocolli Immunocitochimica sono stati ottimizzati per queste colture neuronali dissociate e sono descritte in dettaglio qui. È prevista la procedura di doppia immunocitochimica contro la molecola di adesione neurale cellulare (NCAM) e integrine β1. I dati generati da questi metodi di immunocitochimica sono stati utilizzati per esaminare il patterning spaziale e l&#39;intensità di diverse molecole nei neuroni in coltura 8,16.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="694">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">sterile small culture dishes (35mm)</td>
			<td style="width:176px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">430165</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">sterile large culture dishes (100mm)</td>
			<td style="width:176px;">Falcon</td>
			<td style="width:135px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">sterile large petri dishes (100mm)</td>
			<td style="width:176px;">VWR</td>
			<td style="width:135px;">89000-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">glass petri dish (100mm)</td>
			<td style="width:176px;">VWR</td>
			<td style="width:135px;">D108962&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">fine forceps</td>
			<td style="width:176px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:135px;">11251-10&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">standard forceps</td>
			<td style="width:176px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:135px;">1100-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">coverslips&#160; (22x22)</td>
			<td style="width:176px;">Fisher</td>
			<td style="width:135px;">12 518 105K</td>
			<td>0.13-0.17 mm thickness is optimal for microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">porcelin coverslip holder</td>
			<td style="width:176px;">Thomas scientific</td>
			<td style="width:135px;">8542E40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine serum</td>
			<td style="width:176px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">17502-048</td>
			<td>use 50ml aliquots per 500 mls of Ham&#39;s F12 media&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HCL</td>
			<td style="width:176px;">VWR</td>
			<td style="width:135px;">VW3204-1</td>
			<td>use at 2M, can be used twice before discarding</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:176px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">S9888</td>
			<td>use 5M NaCl solution for laminin-1 stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">laminin-1</td>
			<td style="width:176px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">23017-015</td>
			<td>Add 72ul of sterile 5M NaCl and aliquot into 50ul</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">15 ml conical tube</td>
			<td style="width:176px;">cell treat</td>
			<td style="width:135px;">229411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS CMF 10X</td>
			<td style="width:176px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">14200</td>
			<td>used at 1X, dilute with sterile millipore filtered water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS 10X</td>
			<td style="width:176px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">14080</td>
			<td>used at 1X, dilute with sterile milliporee filtered water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ham&#39;s F12</td>
			<td style="width:176px;">Lonza</td>
			<td style="width:135px;">12-615F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fetal Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:176px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">10438</td>
			<td>use in F12HS20 at 10%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:176px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">H3375</td>
			<td>make sterile 1M solution in distilled water, dilute in F12 media to obtain final concentration of 10mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin streptomyocin</td>
			<td style="width:176px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">P0781</td>
			<td>use 5mls in 500mls of F12 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NT3</td>
			<td style="width:176px;">Millipore</td>
			<td style="width:135px;">GF031</td>
			<td>Add 1ml of sterile millipore water, aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, use at final concentration of 10ng/ml in F12H media, keep in -20 C&#160; non-defrosting freezer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N2</td>
			<td style="width:176px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">17502048</td>
			<td>&#160;aliquot under sterile conditions,stored at -20 0C,&#160; use 100ul per 10ml of F12H media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NGF</td>
			<td style="width:176px;">RnD systems</td>
			<td style="width:135px;">256-GF</td>
			<td>Add 1ml of sterile 1X PBS with 0.1% BSA, aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, usd at final concentration of 10 ng/ml in F12H media&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">l-glutamine</td>
			<td style="width:176px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">G7513</td>
			<td>aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, use at final concentration of 200mM in F12H media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin</td>
			<td style="width:176px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">T4049</td>
			<td>aliquot under sterile conditions, store at -20 0C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:176px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">15260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="231">
			<td height="231" style="height:231px;width:216px;">Other items needed:&#160; general dissection instruments, including&#160; glass pasteur pipettes, fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37 degrees C), cell incubation chamber (humidified, 37&#160; degrees C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting scope</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Immunocytochemistry Reagents Table</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:176px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">S9378</td>
			<td>used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2X PBS)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton-X 100</td>
			<td style="width:176px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">T-8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:176px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">P6148</td>
			<td>used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2X PBS)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluoromount G</td>
			<td style="width:176px;">Southern Biotech</td>
			<td style="width:135px;">0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">normal goat serum</td>
			<td style="width:176px;">Life technologies</td>
			<td style="width:135px;">PCN500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">microscope slides</td>
			<td style="width:176px;">VWR</td>
			<td style="width:135px;">16004-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Primary Antibody Table</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antibody against NCAM</td>
			<td style="width:176px;">Millipore</td>
			<td style="width:135px;">AB5032</td>
			<td>polyclonal</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Antibody against activated beta 1 ingegrin</td>
			<td style="width:176px;">Millipore</td>
			<td style="width:135px;">MAB19294</td>
			<td>monoclonal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Seconday Antibody Table</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Goat anti-mouse IgG Alexa 488</td>
			<td style="width:176px;">Life technologies</td>
			<td style="width:135px;">A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Goat anti-rabbit IgG Alexa 548</td>
			<td style="width:176px;">Life technologies</td>
			<td style="width:135px;">A11036</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of dissociated sensory neurons from chick embryos

I neuroni sono cellule poliedriche che portano le informazioni essenziali per una varietà di funzioni, tra cui la sensazione, movimento del motore, l&#39;apprendimento e la memoria. Studiare i neuroni in vivo può essere difficile a causa della loro complessità, i loro ambienti diversi e dinamici, e limitazioni tecniche. Per queste ragioni, studiando i neuroni in vitro può rivelarsi utile per svelare i complessi misteri di neuroni. Il carattere ben definito di modelli di coltura cellulare fornisce un controllo dettagliato sulle condizioni ambientali e variabili. Qui si descrive come isolare, dissociare, e la cultura neuroni primari di embrioni di pollo. Questa tecnica è rapido, poco costoso, e genera robusta crescita neuroni sensoriali. La procedura produce costantemente le culture che sono altamente arricchito per i neuroni e ha pochissime cellule non neuronali (meno del 5%). Neuroni primari non aderiscono bene al vetro non trattato o di un tessuto culturale di plastica, quindi le procedure dettagliate per la creazione di due distinct, ben definito substrati-laminina contenente per la placcatura neuronale sono descritti. Neuroni in coltura sono altamente suscettibili di molteplici tecniche cellulari e molecolari, tra cui co-immunoprecipitazione, immaginare cellule vive, RNAi, e immunocitochimica. Procedure per doppia immunocitochimica su questi neuroni in coltura sono state ottimizzate e qui descritto.

Il protocollo qui descritto consente agli investigatori di cultura una popolazione arricchita di dissociate neuroni sensoriali embrionali con pochissime cellule (ad esempio, &lt;5%) non neuronali 7,8,10,16. Numerosi DRG possono essere ottenuti dal lombosacrale, toracica e cervicale. A seconda delle esigenze del ricercatore, DRG di queste regioni anatomiche distinte possono essere facilmente isolate. Ad esempio, la figura 1 mostra le immagini del embrione di pollo attraverso varie fas...

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Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Modelli di coltura cellulare forniscono un controllo dettagliato sulle condizioni ambientali e quindi forniscono una potente piattaforma per chiarire numerosi aspetti della biologia delle cellule neuronali. Descriviamo un metodo rapido, economico e affidabile per isolare, dissociare, e la cultura neuroni sensoriali da embrioni di pollo. Sono forniti anche i dettagli di preparazione substrati e immunocitochimica.

Isolamento e Cultura della dissociato neuroni sensoriali da embrioni di gallina

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

isolation-culture-dissociated-sensory-neurons-from-chick

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.2K Views.  Assumption College.  Modelli di coltura cellulare forniscono un controllo dettagliato sulle condizioni ambientali e quindi forniscono una potente piattaforma per chiarire numerosi aspetti della biologia delle cellule neuronali. Descriviamo un metodo rapido, economico e affidabile per isolare, dissociare, e la cultura neuroni sensoriali da embrioni di pollo. Sono forniti anche i dettagli di preparazione substrati e immunocitochimica. 

Video: Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissezione e la cultura di neuroni embrionali commissurali da midollo spinale

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Ricerca

Neuroscienze

The Culture of Primary Motor and Sensory Neurons in Defined Media on Electrospun Poly-L-lactide Nanofiber Scaffolds

Electrospinning is a technique for producing micro- to nano-scale fibers. Fibers can be electrospun with varying degrees of alignment, from highly aligned to completely random. In addition, fibers can be spun from a variety of materials, including biodegradable polymers such as poly-L-lactic acid (PLLA). These characteristics make electrospun fibers suitable for a variety of scaffolding applications in tissue engineering. Our focus is on the use of aligned electrospun fibers for nerve regeneration. We have previously shown that aligned electrospun PLLA fibers direct the outgrowth of both primary sensory and motor neurons in vitro. We maintain that the use of a primary cell culture system is essential when evaluating biomaterials to model real neurons found in vivo as closely as possible. Here, we describe techniques used in our laboratory to electrospin fibrous scaffolds and culture dorsal root ganglia explants, as well as dissociated sensory and motor neurons, on electrospun scaffolds. However, the electrospinning and/or culture techniques presented here are easily adapted for use in other applications.

Aligned electrospun fibers direct the growth of neurons in vitro and are a potential component of nerve regeneration scaffolds. We describe a procedure for preparing electrospun fiber substrates and the serum-free culture of primary rat E15 sensory (DRG) and motor neurons. Visualization of neurons by immunocytochemistry is also included.

La cultura del motore principale e neuroni sensoriali in Media definiti in elettrofilate Poli-L-lactide Ponteggi nanofibre

Electrospinning is a technique for producing micro- to nano-scale fibers. Fibers can be electrospun with varying degrees of alignment, from highly aligned ...

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

Lentivirus-mediata manipolazione genetica e la visualizzazione dei neuroni sensoriali olfattivi In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

Isolamento e la coltura di neuroni ippocampali da topi prenatali

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

Isolamento dei neuroni sensoriali<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Per Bloccare Registrazioni patch di correnti glutamatergico

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is required to shape functional neuronal circuits. The protocol described here explains how to use cell culture inserts bearing a porous membrane (filter) to obtain large amounts of pure axonal preparations suitable for examination by conventional biochemical or immunocytochemical techniques. The functionality of these filter inserts will be demonstrated with models of developmental pruning and Wallerian degeneration, using explants of embryonic dorsal root ganglion. Axonal integrity and function is compromised in a wide variety of neurodegenerative pathologies. Indeed, it is now clear that axonal dysfunction appears much earlier in the course of the disease than neuronal soma loss in several neurodegenerative diseases, indicating that axonal-specific processes are primarily targeted in these disorders. By obtaining pure axonal samples for analysis by molecular and biochemical techniques, this technique has the potential to shed new light into mechanisms regulating the physiology and pathophysiology of axons. This in turn will have an impact in our understanding of the processes that drive degenerative diseases of the nervous system.

This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration.

Produzione e isolamento degli assoni dai neuroni sensoriali per l&#39;analisi biochimica Uso dei filtri porosi

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Isolamento, cultura e lungo termine Manutenzione di primaria mesencefalico neuroni dopaminergici Da Brains embrionali dei roditori

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in communication with the epidermal cells they innervate and thus their analysis benefits from in situ visualization of both neuronally and epidermally expressed proteins by immunofluorescence. Traditional methods of preparing larval fillets for immunofluorescence experiments leave intact the muscle tissue that covers most of the body wall, presenting several challenges to imaging neuronal and epidermal proteins. Here we describe a method for removing muscle tissue from Drosophila larval fillets. This protocol enables imaging of proteins that are otherwise obscured by muscle tissue, improves signal to noise ratio, and facilitates the use of super-resolution microscopy to study da neuron development.

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Studies of neuronal morphogenesis using Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons benefit from in situ visualization of neuronal and epidermal proteins by immunofluorescence. We describe a procedure that improves immunofluorescence analysis of da neurons and surrounding epidermal cells by removing muscle tissue from the larval body wall.

Rimozione di<em&gt; Drosophila</em&gt; Tessuto muscolare da larvali Filetti per l&#39;analisi di immunofluorescenza dei neuroni sensoriali e cellule epidermiche

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

zebrafish<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Preparazione per elettrofisiologiche Le registrazioni da spinale sensoriali e motori neuroni

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

Isolamento e cultura dei neuroni del midollo spinale da topi neonatali

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...