Questo metodo è significativo perché gli organoidi derivati dal paziente forniscono uno strumento rapido e potente per studiare i tumori urologici in quanto spesso imitano l'eterogeneità genetica e fenotipica di questa malattia multispettro. Gli organoidi possono essere isolati da una quantità limitata di materiale bioptico del paziente e possono essere rapidamente espansi per l'analisi a valle. Gli organoidi generati utilizzando questo protocollo possono essere utilizzati sia come modelli per aiutarci a comprendere le basi cellulari e molecolari dei tumori urologici sia come strumenti di medicina di precisione per permetterci di prevedere a quali trattamenti e singoli pazienti il cancro potrebbe rispondere.
Per iniziare, raccogliere un nuovo campione di tumore macroscopicamente vitale dalla chirurgia e assicurarsi che il campione sia immerso nel mezzo di trasporto in un tubo conico sterile da 50 millilitri o in un barattolo di campione di urina durante il transito. Registrare i dettagli del campione, tra cui il peso del tessuto, la descrizione del campione e i dettagli relativi a qualsiasi campione di sangue e urina sul foglio di elaborazione del campione del paziente. Sostituire con cura il mezzo di trasporto con 10 millilitri di mezzi basali e consentire al tessuto tumorale di depositarsi per gravità.
Successivamente, usando una pinza, rimuovere il tessuto tumorale e metterlo in una capsula di Petri sterile da 90 millimetri. Registrare il peso del tessuto in grammi o milligrammi sul foglio di elaborazione del campione clinico e sulla griglia di dissezione. Quindi, utilizzando una pinza sterile in una lama monouso per bisturi montata su un manico di bisturi, rimuovere il tessuto non canceroso e le regioni necrotiche macroscopicamente visibili.
Lavare i pezzi tumorali una o due volte con DPBS freddo, quindi raccoglierli e trasferirli in una nuova capsula di Petri sterile da 90 millimetri. Scatta una fotografia, disegna un diagramma tissutale e pianifica la dissezione del tessuto su una griglia di elaborazione clinica. Per l'analisi istopatologica, posizionare circa 50 milligrammi del tessuto tumorale in una cassetta di istologia plastica monouso etichettata.
Quindi immergere la cassetta istologica in un contenitore con un volume da 5X a 10X di formalina tamponata neutra al 10% e incubare durante la notte. Il giorno seguente, sostituire la formalina con etanolo al 70% per la conservazione a quattro gradi Celsius fino a quando il tessuto non può essere elaborato. Per l'analisi molecolare, congelare a scatto almeno un pezzo di tumore in una RNasi, DNasi libera da 1,5 millilitri crioviale usando azoto liquido e conservare a meno 80 gradi Celsius.
Quindi, erogare cinque millilitri di mezzo organoide nella capsula di Petri da 90 millimetri contenente i restanti pezzi tumorali e tritare meccanicamente il tessuto il più fine possibile. utilizzando una lama sterile numero 10 per bisturi. Trasferire il tessuto finemente tritato in un tubo conico da 50 millilitri e aggiungere quattro millilitri di mezzo organoide, un millilitro di 10X collagenasi / ialuronidasi e 0,1 milligrammi per millilitro DNasi I per evitare l'aggregazione cellulare.
Incubare il tessuto tumorale tritato in soluzione enzimatica per una o due ore su uno shaker orbitale o rotatore in un incubatore per dissociare i frammenti in una sospensione cellulare e abbattere i collageni. Quindi interrompere la digestione aggiungendo il doppio del volume del mezzo basale al campione. Centrifugare il campione, aspirare ed eliminare il surnatante.
Successivamente, per lisare i globuli rossi contaminanti, risospesciare il pellet in cinque millilitri di tampone di potassio cloruro di ammonio e incubare il tubo a temperatura ambiente per tre minuti o fino a quando non si vede la completa lisi dei globuli rossi. Quindi aggiungere 20 millilitri di mezzo basale nel tubo. Centrifugare di nuovo e aspirare il surnatante.
In questa fase, posizionare un'aliquota di 10 millilitri di 2X e 1X mezzo organoide in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per riscaldare. Filtrare prima il campione attraverso un filtro pre-bagnato reversibile da 100 micron in un nuovo tubo da 50 millilitri per rimuovere il materiale insolubile di grandi dimensioni. Quindi filtrare l'elute attraverso un filtro pre-umido reversibile da 37 micron per raccogliere singole cellule in piccoli cluster per l'isolamento di singole cellule e cellule immunitarie.
Quindi, invertire il filtro da 37 micron e aggiungere 10 millilitri di mezzi basali per raccogliere grappoli di piccole e moderate dimensioni. Ricaricare ciascuno di questi nuovi tubi da 50 millilitri con DPBS a 40 millilitri, quindi centrifugare la sospensione ed eliminare il surnatante. Quindi, aggiungere 10 millilitri di media basale al tubo contenente le singole cellule e contare le cellule usando il colorante di esclusione blu tripano in un contatore cellulare automatizzato.
Determinare il numero di cellule e la vitalità delle cellule. Centrifugare il campione rimanente e sostituire il mezzo con soluzione di congelamento cellulare o mezzi basali contenenti 10% di siero bovino fetale 1% penicillina e streptomicina e 10% DMSO, quindi posizionare i campioni in crioviali da 1,5 millilitri, conservarli in un contenitore autogelante e trasferire immediatamente i contenitori in un congelatore a meno 80 gradi Celsius. Il giorno successivo, trasferire i crioviali in liquido criogenico o in fase aria per la conservazione a lungo termine.
Successivamente, risospesci i cluster raccolti di piccole e medie dimensioni con 500 microlitri di mezzo organoide 2X preriscaldato. Quindi con le punte della pipetta del filtro sterile P-1000 ghiacciate, aggiungere BME alle celle e mescolare delicatamente. Pipettare rapidamente e con attenzione 100 microlitri della miscela BME di celle ricostituite a pozzetti di un attacco ultra basso, piastra a fondo piatto a 96 pozzetti e posizionare la piastra in un'incubatrice per 20-30 minuti per solidificare.
Dopo l'incubazione aggiungere un mezzo organoide sopra la sospensione cellulare BME in un rapporto uno a due a seconda del volume valutato empiricamente e posizionare la piastra in un incubatore per 20 minuti per equilibrare. Dopo l'incubazione, rimuovere la piastra dall'incubatore e assemblarla su un portacampioni sul palco di un microscopio per valutare visivamente gli organoidi in contrasto di fase o impostazioni di campo luminoso. Ricarica il mezzo ogni due o tre giorni utilizzando 50 microlitri di mezzo organoide preriscaldato per ricostituire i fattori di crescita esauriti e il volume complessivo.
Acquisisci le immagini della serie time-lapse nei giorni 1, 2 e 3 e 5, 7 e 10 prima di passare. La digestione di due ore del tessuto tumorale della vescica con collagenasi / ialuronidasi e DNasi I disponibili in commercio porta a una digestione sufficiente di 0,5-1 millimetro cubo di pezzi di tessuto bioptico di cistectomia più complesso, comprese le cellule neoplastiche all'interno della lamina propria e gli strati muscolari della vescica. Frammenti post-digestione più grandi sono adatti per la coltura e le piastre di coltura tissutale standard di qualsiasi dimensione per isolare nuove colture bidimensionali.
Gli organoidi generati da questa procedura subiscono un autoassemblaggio dinamico, comprese le fasi di aggregazione, compattazione e formazione finale di strutture cellulari strette. Istologicamente, queste strutture ricapitolano il tumore originale del paziente. Gli organoidi generati in questa procedura sono adatti a molti scopi, tra cui un'ulteriore caratterizzazione istopatologica, il biobanking e i test di efficacia dei farmaci.
Dopo la generazione di organoidi, ulteriori metodi possono essere utilizzati per profilare questi tumori, tra cui il ruolo delle terapie anti-cancro, la profilazione metabolica o il profilo di trascrizione. All'interno di questo quadro 3D, queste metodologie aggiuntive forniscono potenti informazioni sulla biologia del cancro alla vescica. Questo metodo è stato una base importante per gli studi che studiano l'immunooncologia e il metabolismo cellulare.
