Il protocollo fornisce un metodo di coltura cellulare primaria facile da gestire e ampiamente compatibile per gli invertebrati marini. Questa tecnica offre ai ricercatori un modo per coltura delle cellule invertebrate marine per un tempo relativamente lungo. Una coltura di cellule dovrebbe essere fornita con un background genetico coerente per diverse ulteriori applicazioni biologiche sperimentali nella ricerca sulla biologia marina.
Per quanto riguarda la nuova ricerca in questo campo, riteniamo che il protocollo semplificato indicato debba essere la buona scelta da esercitare. Dopo l'anestesia, sezionare e raccogliere l'intestino anteriore, quindi sezionare i campioni di tessuto verticalmente e rimuovere il contenuto interno. Lavare i campioni di tessuto in PBS due volte e disinfettarli per immersione in una soluzione di etanolo al 75% per non più di due secondi.
Quindi lavare i campioni di tessuto in PBS tre volte per rimuovere l'etanolo e trasferire circa 100 milligrammi di campione di tessuto in un tubo di micro centrifuga sterile a due millilitri. Aggiungere 1,5 millilitri di mezzo di coltura pre-ottimizzato al blocco del tessuto intestinale del cetriolo marino e tritare il blocco con forbici chirurgiche sterilizzate fino a quando la soluzione è torbide. Aggiungere 400 microlitri dello 0,25% di tripside.
Mescolare la soluzione per inversione e incubarla per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi filtrare la soluzione utilizzando un colino a celle da 100 micron e raccogliere il filtrato in un nuovo tubo sterile a micro centrifuga a due millilitri. Per il protocollo semplificato opzionale, i blocchi di tessuto tagliati in supporti coltivati possono essere trasferiti direttamente nei piatti e successivamente incubati.
Centrifugare il tubo a 1700xG per tre minuti, scartare il supernatante, quindi sospendere di nuovo il pellet nel mezzo di coltura con antibiotici e lavarlo due volte con mezzo di coltura. Pre-impostare l'incubatore per la coltura cellulare e eseguito in anticipo per almeno 24 ore con la temperatura di 18 gradi Celsius e l'umidità satura. Quindi sospendere di nuovo le celle utilizzando 200 microlitri di mezzo indicato e trasferirle in piatti di quattro centimetri.
Coltura delle cellule in un'incubatrice. Dopo sei ore, estenerli dall'incubatrice e aggiungere due millilitri di mezzo indicato ai piatti di coltivazione cellulare. Ogni 12 ore, cambia metà del mezzo.
Dopo cinque o sette giorni, le cellule iniziano a dividersi. Ridurre gli effetti avversi degli antibiotici riducendo della metà la concentrazione di antibiotici, penicillina, streptomicina e gentamicina indicati nel mezzo di coltura. Ogni due o tre giorni, sostituire il mezzo di coltura cellulare.
Quando la densità della cella primaria raggiunge il 60% conduce la passaging cellulare. In primo luogo, lavare le cellule coltivate due volte utilizzando PBS a temperatura ambiente. Aggiungere 200 microlitri di soluzione di tripside allo 0,25% ad ogni piatto e agitare manualmente i piatti, assicurandosi che l'intero fondo sia coperto.
Scartare la soluzione di tripina e incubare le cellule per cinque minuti a temperatura ambiente. Lavare le cellule con un millilitro di mezzo di coltura fresco pipettando e sospendendo di nuovo le cellule. Trasferire 0,5 millilitri di sospensione cellulare in un nuovo piatto.
Aggiungere 1,5 millilitri di mezzo fresco e incubare le cellule a 18 gradi Celsius. Dopo 12 ore, cambiare il mezzo e osservare le cellule al microscopio per valutare le condizioni. Preparare tre gruppi sperimentali, tra cui un controllo, e due gruppi di soluzioni, con un deximethazone micromolare e 100 micromolare.
Dopo l'incubazione con o senza deximethazone per zero, 24 o 48 ore, lavare le cellule tre volte con PBS. Dopo aver spento la luce, aggiungere 300 microlitri di soluzione hoechst 33258 per pozzo a una piastra di 12 pozzi e agitare delicatamente la piastra per coprire tutte le celle, garantendone la colorazione. Incubare a 18 gradi Celsius per 30 minuti.
Quindi rimuovere la soluzione di colorazione hoechst e fissare le cellule aggiungendo 300 microlitri di soluzione di paraformaldeide al quattro per cento in PBS ad ogni pozzo. Agitare delicatamente per 15 minuti. Successivamente, lavare le cellule fisse tre volte in PBS.
Mantenere il PBS dopo l'ultimo lavaggio per mantenere le celle coperte. Accendi l'hardware del microscopio fluorescente, tra cui la potenza della lampada a mercurio, la potenza della luce fluorescente e il PC. Accedere all'account del sistema operativo, avviare il software e verificarne la configurazione. Posizionare la piastra preparata sullo stadio del microscopio.
Posizionare il campione sull'obiettivo utilizzando il controller del palco. Trova le cellule di interesse al microscopio luminoso. Passare alla microscopia fluorescente e regolare i parametri dell'eccitazione e dell'emissione a circa 352 e 461 nanometri, rispettivamente, per l'osservazione del DNA dei nuclei.
Acquisire le immagini. In questo studio, è stata stabilita e passaggi la coltura cellulare intestinale primaria del cetriolo marino. Qui vengono mostrate cellule rotonde in diverse fasi di lavorazione.
Qui ci sono cellule attaccate al fondo dei piatti il terzo giorno, dopo essere state seminate. Ecco la proliferazione cellulare il settimo giorno. Qui ci sono cellule attaccate al fondo dei piatti dopo la passaging.
E cellule che hanno perso attività e stavano morendo dopo 10 passaggi. L'EDU che afferma i saggi fornisce prove dirette per rivelare l'attività proliferativa di queste cellule rotonde nelle fasi successive. La stimolazione con un deximethazone micromolare ha aumentato la velocità cellulare apoptotica più rapidamente, rispetto al controllo e alla stimolazione di deximethazone micromolare 100 micromolare.
Le cellule coltivate sono state trattate con deximethazone per diversi periodi di tempo, seguite dalla colorazione hoechst 33258 per il rilevamento di cellule apoptotiche. I trattamenti cellulari prima dell'incubazione sono fondamentali per il controllo a lungo termine. È un promemoria per provare il protocollo semplificato opzionale quando la cella non cresce bene.
La paraformaldeide è moderatamente tossica per contatto con la pelle o inalazione, ed è documentata come cancerogeno probabilmente umano.
