Questo protocollo può essere utilizzato per ottimizzare le concentrazioni di proteine e anticorpi primari in una singola piastra di dosaggio e per eseguire due test utilizzando una singola preparazione del campione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di completare 2 giorni e mezzo di lavoro di laboratorio, compresa l'analisi dei dati, in 3 ore e mezza. Questa tecnica fornisce un formato di test ad alta produttività per lo sviluppo di un biomarcatore a base di sangue per la SS ED ed è un metodo ideale per condurre studi clinici di grandi dimensioni.
Questo metodo può fornire informazioni sui profili proteici target durante la prognosi della malattia e può facilitare il monitoraggio degli effetti dei farmaci di interessanti studi clinici. Dopo aver raccolto 100 microlitri di lire piastrine umane da pazienti affetti da SS E soggetti sani, compilare modelli generati internamente per il layout capillare e la preparazione del campione. La tabella di preparazione della miscela campione è dinamica e calcolerà automaticamente quanto volume deve essere rimosso dalla fonte.
Metti tutti i reagenti del saggio sul ghiaccio. Tranne la confezione standard, che dovrebbe rimanere a temperatura ambiente. Per preparare il master mix fluorescente, aggiungere 40 microlitri di acqua deionizzata a un tubo trasparente di DTT e aggiungere 20 microlitri di tampone campione 10X.
E 20 microlitri della soluzione DTT da 400 millimolare preparata al tubo rosa dal kit di dosaggio. Per preparare la scala biotinilata, aggiungere 16 microlitri di acqua deionizzata, due microlitri di tampone campione 10X e due microlitri della soluzione DTT da 400 millimolare preparata al tubo bianco fornito nel kit. Dopo una miscelazione delicata, trasferire la soluzione di scaletta in un tubo PCR da 200 microliter prima della denaturazione.
Aggiungere 1,5 microlitri di tampone campione 10X e 148,5 microlitri di acqua deionizzata a un tubo e vortice di microcentrifugo da 600 microlitri da mescolare, prima di posizionare il tubo sul ghiaccio. Aggiungere gli anticorpi di interesse direttamente il diluente come indicato nella tabella e sciacquare la punta della pipetta più volte in una soluzione anticorpale omogenea. Per preparare la miscela di campioni capillari, aprire tutti i tubi PCR e aggiungere aliquote di 1,6 microliter di tampone campione fluorescente 5X a ciascun tubo come indicato nella tabella utilizzando una tecnica di pipettazione inversa.
Chiudere immediatamente ogni tubo man mano che viene aggiunto il buffer. Una volta aggiunto tutto il buffer, aprire tutti i tubi e aggiungere un tampone campione 0,1X in volumi come indicato nella tabella, chiudendo immediatamente ogni tubo man mano che viene aggiunto il buffer. Quindi, aprire tutti i tubi e aggiungere i campioni proteici come indicato nella tabella e chiudere immediatamente ogni tappo del tubo.
Una volta aggiunti tutti i campioni, centrifugare brevemente tutti i tubi in una centrifuga da banco. Vortice per mescolare e centrifugare di nuovo i campioni. Alla fine della seconda centrifugazione, posizionare tutti i tubi in un termociclo con coperchio riscaldato.
E denaturare i campioni nelle condizioni indicate. Al termine della denaturazione, centrifugare, mescolare e centrifugare nuovamente i campioni e posizionare tutti i tubi in una griglia di tubi sul ghiaccio. Usando la figura come guida, aggiungere 10 microlitri di perossidasi di rafano streptavidina al pozzo D1, 10 microlitri dell'anticorpo secondario appropriato per i pozzi da D2 a D5, 10 microlitri di diluente anticorpale ad ogni pozzo nella fila B e al pozzo C1, 10 microlitri dell'anticorpo primario appropriato ai pozzi da C2 a C25, cinque microlitri di scala biotinilata dal tubo PCR numero uno al pozzo A1 , tre microlitri di campione fino alle file da A2 a A25 e 15 microlitri di perossido di luminolo appena preparato ad ogni pozzo di fila E.Pipetting la miscela di campioni e il reagente nel piccolo pozzo negli ordini corretti è fondamentale per il successo dell'esperimento, quindi dovrebbe essere fatto con molta attenzione.
Quindi aggiungere 500 microlitri di tampone di lavaggio a ciascun tampone di lavaggio designato bene. E spin giù il contenuto della piastra per centrifugazione. Per eseguire l'analisi capillare sulla piastra di dosaggio, collegare l'analizzatore capillare al sistema online e fare clic su Strumento e connessione nel software dell'analizzatore.
Selezionare il numero di serie dello strumento all'interno del menu di scelta rapida e fare clic su Connetti. Selezionare la scheda Test e quindi Nuovo saggio, immettere i parametri di test e salvare il nome e il percorso del file. Quindi confermare che l'indicatore blu lampeggiante nell'analizzatore è un blu solido e rimuovere la cartuccia capillare dalla sua confezione.
Rimuovere il sigillo protettivo dalla piastra di dosaggio e osservare visivamente i pozzi preriempati per le bolle d'aria. Posizionare la piastra di dosaggio nel supporto della piastra e tenere la cartuccia capillare ad angolo, inserire la cartuccia nello slot capillare e chiudere la porta dell'analizzatore. Quindi fare clic sul pulsante Start nel software dell'analizzatore.
L'uso di un'intera miscela di lisato piastrinica nel saggio può ridurre l'intensità del segnale delle proteine bersaglio e contribuire a un segnale di fondo elevato. Pertanto, in questo saggio, il supernatante chiaro è stato utilizzato dopo aver ruttato le piastrine. Un intervallo dinamico lineare per la concentrazione di proteina citosol piastrinica è stato stabilito da 0,2 a 0,8 milligrammi per millilitro, ed è stato adottato un modello di saggio in modo che sia la concentrazione proteica che la titolazione primaria degli anticorpi possano essere eseguite in un singolo saggio.
L'elevato profilo di rilevamento dell'intervallo dinamico offre una gamma dinamica significativamente più ampia grazie alla maggiore sensibilità del saggio capillare, con conseguente migliore rilevamento e quantificazione su un intervallo di concentrazione del campione più ampio. È inoltre possibile definire i tempi di esposizione individuali. Utilizzando le condizioni di dosaggio ottimizzate, questa analisi delle frazioni citosoliche di lisato piastrinico ottenute da pazienti affetti da SLA utilizzando due serie di anticorpi consente l'identificazione del TDP-43 specifico della malattia e della sua derivata fosforilata all'interno dei campioni.
Il TDP-43 totale potrebbe quindi essere quantificato utilizzando la curva di calibrazione. E le variabilità del saggio intra e inter-run sono state testate in frazioni citosoliche piastriche PIAstrinica umane raggruppate. Questo metodo consente l'uso di anticorpi primari, facilitando l'identificazione di un massimo di cinque diverse proteine bersaglio all'interno dello stesso campione in un singolo test.
Questa tecnica non solo riduce sostanzialmente il tempo di analisi delle proteine, ma richiede volumi di campioni di microliter e genera risultati con un alto grado di riproducibilità. Alcune delle sostanze chimiche utilizzate in questo saggio e tutti i campioni umani sono considerati pericolosi per l'uomo, per cui nell'esecuzione di questi esperimenti dovrebbero sempre essere utilizzati dispositivi di protezione individuale appropriati.
