Name: osteoarthritis pain model induced by intra-articular injection of mono-iodoacetate in rats
Uploaded: 2020-05-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Osteoarthritis Pain Model Induced by Intra-Articular Injection of Mono-Iodoacetate in Rats at JoVE.com

Questo studio è stato finanziato dalla Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China (Grant No: LY17H270016), dalla National Natural Science Foundation of China (Grant No: 81774331, 81873049 e 81673997) e dallo Zhejiang Provincial Science and Technology Project of Traditional Chinese Medicine of China (Grant No: 2013ZQ007 e 2016ZZ011).

Le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dal Comitato per le norme mediche e l'etica dell'Università medica cinese di Zhejiang e sono conformi alla legislazione cinese sull'uso e la cura degli animali da laboratorio.
1. Iniezione intra-articolare di mono-iodoacetato nel ginocchio
<ol><li>Dopo una settimana di acclimatazione, dividere casualmente e equamente 40 ratti maschi di Sprague-Dawley del peso di 180-200 g (4-5 settimane) in quattro gruppi (n = 10 ratti / gruppo). NOTA: I ratti nel gruppo di controllo saranno iniettati intra-articolarmente con 50 μL di soluzione salina, mentre i ratti nei gruppi sperimentali saranno trattati con 0,5, 1,5 o 3 mg di MIA disciolto in 50 μL di soluzione salina, rispettivamente.</li>
	<li>Il giorno dell'iniezione, preparare appena la soluzione di MIA in soluzione salina sterile (0,9% NaCl) a 15, 30 e 60 mg/ml di concentrazione e pentobarbital al 10% in soluzione salina sterile (0,9% NaCl). ATTENZIONE: MIA ha un effetto estremamente distruttivo sulla mucosa, il tratto respiratorio superiore, l'occhio e la pelle e altri tessuti. Pertanto, si raccomandano maschera e guanti quando si prepara una soluzione.</li>
	<li>Anestetizzare i ratti mediante iniezione intraperitoneale di ketamina a 60 mg/kg e xilazina a 5 mg/kg (entrambi preparati in soluzione salina). Bloccare delicatamente le dita dei piedi del topo con una pinzetta per confermare l'anestesia.</li>
	<li>Posiziona il topo con la schiena rivolta verso il basso. Rasare il ginocchio e pulire l'area circostante l'articolazione del ginocchio con alcool.</li>
	<li>Tieni il ginocchio con un angolo di 90° e rivela il tendine rotuleo bianco sotto la rotula. Premere il tendine rotuleo con la punta del dito per trovare lo spazio sotto la rotula.</li>
	<li>Scegli la giunzione dello spazio e il tendine rotuleo laterale come sito di iniezione. Quindi, inserire l'ago da 26 G verticalmente nel sito di circa 5 mm. Nessuna resistenza dovrebbe essere avvertita quando l'ago si trova nello spazio articolare. NOTA: È importante mantenere l'ago perpendicolare al sito di iniezione.</li>
	<li>Iniettare 50 μL di soluzione salina o MIA nella cavità articolare. Estrarre lentamente l'ago e avvolgere un pezzo di garza attorno al sito di iniezione per ridurre al minimo il reflusso e le perdite. Dopo il recupero dell'anestesia, rimuovere la garza.</li>
	<li>Test del comportamento correlato al dolore a 1, 7, 14, 21, 28 e 35 giorni dopo le iniezioni come descritto nel paragrafo 2.</li>
</ol>2. Valutazioni comportamentali
<ol><li>Soglia di prelievo meccanico (MWT) NOTA: Il MWT è stato misurato dal test di von Frey13 e l'osservatore è stato accecato alle iniezioni che gli animali avevano ricevuto.<ol><li>Metti un topo in una gabbia di plastica sopraelevata (17 cm x 11 cm x 13 cm) con una base di rete metallica sospesa a 50 cm sopra un tavolo. Assicurarsi che l'ambiente di prova sia silenzioso e dare al ratto 30 minuti per adattarsi all'ambiente.</li>
		<li>Premere l'ago di von Frey perpendicolarmente sulla superficie plantare della zampa posteriore di ciascun ratto. Aumentare la pressione gradualmente (circa 20 g/s) e linearmente fino a quando non si verifica il sollevamento della zampa o la leccatura della zampa.</li>
		<li>Utilizzare una forza inferiore alla soglia precedente per assicurarsi che la soglia sia la forza di prelievo minima. Testare ogni ratto più di tre volte, ad almeno 3-5 minuti di distanza.</li>
		<li>Registra la forza minima che provoca un riflesso di ritiro della zampa. Media dei dati come MWT dei ratti.</li>
	</ol></li>
	<li>Latenza di prelievo termico (TWL) NOTA: Il TWL è stato misurato utilizzando l'apparecchiatura di prova plantare (Table of Materials) e l'osservatore è stato accecato alle iniezioni che gli animali avevano ricevuto.<ol><li>Posizionare una scatola di plexiglass (60 cm x 20 cm x 14 cm, divisa in 6 scomparti) su una lastra di vetro spessa 3 mm e inserire i ratti nella scatola (uno in ogni scomparto). Assicurati che l'ambiente sia silenzioso e che la temperatura ambiente sia costante.</li>
		<li>Dare ai ratti 30 minuti per adattarsi all'ambiente di test.</li>
		<li>Calibrare lo stimolo termico tramite il radiometro a infrarossi. Impostare l'intensità infrarossa desiderata su 70 unità.</li>
		<li>Posizionare l'emettitore/rilevatore a infrarossi sul contenitore direttamente sotto il centro della zampa da testare.</li>
		<li>Premendo il pulsante START . Il timer si avvierà automaticamente. Il controller spegnerà automaticamente la luce a infrarossi e interromperà del tutto il timer non appena si verifica il movimento della zampa.</li>
		<li>Registra il tempo di reazione quando la comparsa del ritiro della zampa e la leccatura della zampa. NOTA: Una risposta positiva per il test è considerata come ritiro della zampa e leccata della zampa. Se si verifica solo il ritiro della zampa, dovrebbe essere considerato come un movimento volontario del ratto piuttosto che una risposta positiva.</li>
		<li>Ripeti il test più di tre volte. Media dei dati come il TWL dei ratti. NOTA: Ogni esposizione di calore radiante non deve superare i 20 s. Le stimolazioni a infrarossi sulla stessa zampa posteriore dovrebbero essere distanti almeno 3-5 minuti.</li>
	</ol></li>
	<li>Analisi del modello di andatura NOTA: Le analisi del modello di andatura sono state misurate utilizzando un sistema di imaging (Table of Materials) e l'osservatore è stato accecato alle iniezioni che gli animali avevano ricevuto.<ol><li>Regolare la lunghezza del compartimento pedonale utilizzando le manopole su entrambe le estremità del compartimento pedonale alla lunghezza adatta per i ratti (ad esempio, 61 cm).</li>
		<li>Metti un topo nello scompartimento pedonale e addestra i ratti a fare corse ininterrotte per almeno 5 cicli di passi ad una velocità di 18 cm / s prima dell'esperimento formale. NOTA: Quando un ratto viene posizionato per la prima volta nello scompartimento pedonale, la velocità può essere impostata su circa 20 cm / s e disattivata quando si corre intorno a 2 s. Quindi impostare la velocità su 18 cm/s. Picchiettare delicatamente la parte posteriore del topo con la partizione, se il topo si ferma o si ritira durante la camminata. Cerca di ridurre gradualmente la velocità da 18 cm/s a 10 cm/s. Se il ratto alla fine non riesce a eseguire il test, è accettabile scegliere un altro ratto per il test.</li>
		<li>Aumentare lentamente la velocità del tapis roulant fino a raggiungere la velocità target (18 cm/s). Cattura almeno 5 s video di movimento continuo del ratto con la videocamera digitale ad alta velocità montata sotto la cintura trasparente del tapis roulant.</li>
		<li>Testare ogni ratto ad almeno 5 minuti di distanza per ottenere almeno tre corse ininterrotte.</li>
		<li>Disegna un "riquadro di delimitazione" per definire il confine dell'immagine dell'animale che cammina nel software di imaging e inserisci la velocità di esecuzione per ogni video. Seleziona i video come gruppo ed elabora i video automaticamente dal software. Dopo aver elaborato i video, il software produrrà diversi fogli di calcolo per segnalare gli indici di andatura, tra cui posizione, oscillazione, frenata, propulsione, cadenza, sequenza di passi, ecc.</li>
		<li>Calcola l'area totale della zampa (cm2), la lunghezza media del passo (cm) e unisci la lunghezza del passo. NOTA: L'area totale della zampa è la media dell'area totale di quattro zampe di ciascun gruppo di ratti e l'area della zampa è definita come l'area massima della zampa a contatto con il tapis roulant durante la fase di posizione del ciclo di passi. La lunghezza del passo è la distanza tra i contatti iniziali della stessa zampa in un passo completo. Lunghezza unitaria del passo = lunghezza media del passo (cm)/lunghezza del corpo (cm).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Analisi istopatologiche e immunoistochimiche
<ol><li>Eutanasia ratti mediante iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodico a 150 mg/kg (preparato in soluzione salina). Resecare immediatamente le articolazioni del ginocchio per le analisi istologiche.</li>
	<li>Fissare le articolazioni in formalina al 10% per 24 ore, decalcificare con EDTA al 10% in soluzione salina tamponata fosfato (PBS) per 8 settimane, quindi incorporare le articolazioni in paraffina. ATTENZIONE: La formalina può causare irritazione agli occhi, alla pelle e alle vie respiratorie. Dovrebbe essere maneggiato in un cappuccio.</li>
	<li>Sezionare i giunti incorporati in paraffina a 3 mm di spessore con un microtomo e galleggiare in un bagnomaria a 40 °C contenente acqua distillata.</li>
	<li>Trasferire le sezioni su vetrini. Asciugare i vetrini per una notte e conservare i vetrini a temperatura ambiente (RT) per continuare la colorazione successiva.</li>
	<li>Mettere i vetrini in forno a 60 °C per 4 ore per deparaffinizzare.</li>
	<li>Immergere le diapositive successivamente in xilene, xilene, etanolo al 100%, etanolo al 100%, etanolo al 95%, etanolo all'80% e etanolo al 75% per 5 minuti, rispettivamente, a RT.</li>
	<li>Sezioni di colorazione con ematossilina ed eosina (H & E), safranina-O (SO) ed ematossilina blu di Alcian (ABH), nonché anticorpi contro il collagene di tipo II di ratto (Col2), il collagene di tipo X (Col10) e la metalloproteinasi della matrice 13 (MMP13), come descritto nei passaggi 3.8-3.12.</li>
	<li>Colorazione H&E<ol><li>Risciacquare i vetrini con H2O deionizzato per 3 min. Colorare i vetrini con ematossilina per 3-5 minuti.</li>
		<li>Risciacquare i vetrini con H2O 3x deionizzato, 1 minuto ciascuno, fino a quando non rimane ematossilina sulla superficie.</li>
		<li>Diapositive colorate con eosina per 30 s. Quindi, sciacquare i vetrini con H2O 3x deionizzato, 1 minuto ciascuno, fino a quando non rimane eosina sulla superficie.</li>
		<li>Immergere i vetrini in ammoniaca allo 0,1% per 10-20 s. Quindi, sciacquare i vetrini con H2O 3x deionizzato, 1 min ciascuno.</li>
		<li>Immergere i vetrini successivamente in etanolo al 95%, etanolo al 100%, xilene, xilene e xilene per 1 minuto, rispettivamente.</li>
		<li>Copri le guide con resina neutra.</li>
	</ol></li>
	<li>Colorazione SO<ol><li>Risciacquare i vetrini con H2O deionizzato per 3 min. Colorare i vetrini con ematossilina per 3-5 minuti.</li>
		<li>Differenziare rapidamente in alcool acido all'1% (circa 3 s). Quindi, sciacquare i vetrini con H2O 3x deionizzato, 1 minuto ciascuno, fino a quando non rimane ematossilina sulla superficie.</li>
		<li>Vetrini con soluzione Fast Green (FCF) per 5 min. Quindi, sciacquare i vetrini con H2O 3x deionizzato, 1 min ciascuno.</li>
		<li>Colorare i vetrini con SO per 1−2 min. Quindi, sciacquare i vetrini con H2O 3x deionizzato, 1 min ciascuno.</li>
		<li>Risciacquare i vetrini con acido acetico all'1% per 1-2 minuti per rimuovere il FCF residuo. Risciacquare i vetrini con H2O deionizzato per 1 min.</li>
		<li>Immergere i vetrini successivamente in etanolo al 95%, etanolo al 100%, xilene, xilene e xilene per 1 minuto, rispettivamente.</li>
		<li>Copri le guide con resina neutra.</li>
	</ol></li>
	<li>Colorazione ABH<ol><li>Risciacquare i vetrini con H2O deionizzato per 3 min. Immergere i vetrini in alcool acido all'1% per 30 secondi e scolare brevemente su un tovagliolo di carta (non risciacquare).</li>
		<li>Immergere le diapositive in ABH per 1 ora. Quindi, sciacquare i vetrini con H2O 3x deionizzato, 1 minuto ciascuno, fino a quando non rimane ABH sulla superficie.</li>
		<li>Differenziare rapidamente in alcool acido all'1% (circa 3 s). Risciacquare i vetrini con H2O 3x deionizzati, 1 min ciascuno.</li>
		<li>Immergere i vetrini in acqua di ammonio allo 0,5% per 15 s. Quindi, sciacquare i vetrini con H2O 3x deionizzato, 1 min ciascuno.</li>
		<li>Immergere i vetrini in etanolo al 95% per 1 minuto. Immergere i vetrini in una soluzione G di eosina/arancia per 1,5 minuti.</li>
		<li>Immergere i vetrini successivamente in etanolo al 95%, etanolo al 100%, xilene, xilene e xilene per 1 minuto, rispettivamente.</li>
		<li>Copri le guide con resina neutra.</li>
	</ol></li>
	<li>Esaminare tutti i vetrini al microscopio e valutare statisticamente su una scala da 0 a 13 mediante osservazione in doppio cieco, secondo il sistema di punteggio14 di Mankin.</li>
	<li>Immunoistochimica<ol><li>Risciacquare i vetrini con H2O deionizzato per 3 min.</li>
		<li>Immergere i vetrini in citrato di sodio 0,1 M e posizionare i vetrini in un forno a 60 °C per 4 ore per recuperare l'antigene.</li>
		<li>Immergi le diapositive in Triton X-100 allo 0,3% in PBS per 10 minuti. Quindi, sciacquare i vetrini con PBS 2x, 3 minuti ciascuno.</li>
		<li>Incubare sezioni in soluzione di H2 O2 al 3% in metanolo a RT per 10 minuti per bloccare l'attività della perossidasi endogena. Risciacquare i vetrini con PBS 2x, 3 min ciascuno.</li>
		<li>Incubare le sezioni con siero di capra al 5% in PBS per 30 minuti a RT per bloccare qualsiasi legame non specifico. Risciacquare i vetrini con PBS 2x, 3 min ciascuno.</li>
		<li>Incubare le sezioni per una notte a 4 °C con 100 μL di anticorpi primari PBS-diluiti (1:1.000) contro il collagene di tipo II (Col2), il collagene di tipo X (Col10) e la metalloproteinasi della matrice 13 (MMP13). Risciacquare i vetrini con PBS 2x, 3 min ciascuno.</li>
		<li>Incubare le sezioni con 100 μL di anticorpo secondario diluito PBS (1:1.000) (secondario anti-topo di capra o secondario anti-topo di capra) per 20 minuti a RT. Risciacquare i vetrini con PBS 2x, 3 min ciascuno.</li>
		<li>Incubare sezioni con 100 μL di soluzione di lavoro 3,3′-diaminobenzidina (DAB). Monitorare la reazione mentre la reazione cromogenica trasforma i siti dell'epitopo in marrone. ATTENZIONE: DAB è cancerogeno. Indossare sempre guanti e lavorare in un cappuccio quando si lavora con DAB. NOTA: Il tempo di sviluppo del colore può variare da pochi secondi a 10 minuti.</li>
		<li>Non appena si sviluppa un colore marrone sulle sezioni, sciacquare i vetrini con H2O 2x deionizzati, 3 minuti ciascuno.</li>
		<li>Immergere i vetrini nell'ematossilina per 1-2 minuti per contrastare i vetrini. Quindi, sciacquare i vetrini con H2O 3x deionizzato, 1 min ciascuno.</li>
		<li>Immergere i vetrini successivamente in etanolo al 95%, etanolo al 100%, xilene, xilene e xilene per 1 minuto, rispettivamente.</li>
		<li>Copri le guide con resina neutra.</li>
		<li>Osservare il colore della colorazione anticorpale nelle sezioni al microscopio.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+gait,+due+to+inflammation+but+not+nerve+injury,+reflects+enhanced+nociception+in+preclinical+pain+models.">Abnormal gait, due to inflammation but not nerve injury, reflects enhanced nociception in preclinical pain models.</a> Brain Research. 1295, 89-98 (2009).</li><li>Udo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoiodoacetic+acid+induces+arthritis+and+synovitis+in+rats+in+a+dose-+and+time-dependent+manner:+proposed+model-specific+scoring+systems.">Monoiodoacetic acid induces arthritis and synovitis in rats in a dose- and time-dependent manner: proposed model-specific scoring systems.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 24 (7), 1284-1291 (2016).</li><li>Guingamp, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mono-iodoacetate-induced+experimental+osteoarthritis:+a+dose-response+study+of+loss+of+mobility,+morphology,+and+biochemistry.">Mono-iodoacetate-induced experimental osteoarthritis: a dose-response study of loss of mobility, morphology, and biochemistry.</a> Arthritis &amp; Rheumatism. 40 (9), 1670-1679 (1997).</li><li>Jeong, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eupatilin+Exerts+Antinociceptive+and+Chondroprotective+Properties+in+a+Rat+Model+of+Osteoarthritis+by+Downregulating+Oxidative+Damage+and+Catabolic+Activity+in+Chondrocytes.">Eupatilin Exerts Antinociceptive and Chondroprotective Properties in a Rat Model of Osteoarthritis by Downregulating Oxidative Damage and Catabolic Activity in Chondrocytes.</a> PLoS ONE. 10 (6), 0130882 (2015).</li><li>Cook, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+cartilage+repair.">Animal models of cartilage repair.</a> Bone &amp; Joint Research. 3 (4), 89-94 (2014).</li><li>Little, C. B., Zaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+constitutes+an+"animal+model+of+osteoarthritis"--the+need+for+consensus.">What constitutes an "animal model of osteoarthritis"--the need for consensus.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 20 (4), 261-267 (2012).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il modello di ratto di OA indotto da MIA è un modello consolidato e ampiamente utilizzato. L'iniezione intra-articolare di MIA provoca inizialmente un'infiammazione grave e acuta, che dà origine alla fase più lunga e degenerativa di OA17,18. In questa ricerca, abbiamo misurato la sensibilità nocicettiva mediante MWT e TWL e valutato le alterazioni dell'andatura con un sistema di imaging. Rapporti precedenti hanno rilevato che l'iniezione di MIA potrebbe aumen...

L'osteoartrite (OA) è la malattia articolare più comune al mondo, che colpisce circa il 10-12% delle popolazioni negli adulti1. L'articolazione più generalmente coinvolta è il ginocchio e l'OA ha una maggiore incidenza negli anziani, in particolare nelle donne2. Come malattia cronica, l'OA si sviluppa progressivamente nel corso dei decenni in insufficienza articolare con sintomi come perdita di cartilagine, infiammazione sinoviale, osteofitosi, diminuzione della funzione e dolore cronico3. Secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), l'OA è la quarta malattia più diffusa nelle femmine e l'ottava malattia più diffusa nei maschi. Entro il 2020, l'OA potrebbe diventare la quarta malattia più invalidante nell'uomo4. Tuttavia, le terapie attualmente disponibili di OA affrontano solo i sintomi e prolungano il tempo fino all'intervento chirurgico di sostituzione articolare5.
L'OA spontanea nei pazienti umani spesso richiede molto tempo per produrre sintomi clinici come il dolore articolare correlato6. Nelle prime fasi dell'OA, il dolore è solitamente intermittente e diventa più frequente e grave con il progredire della malattia, rendendolo il reclamo predominante dei pazienti7. Pertanto, nell'ultimo mezzo secolo sono stati sviluppati ampi modelli animali per il dolore OA per promuovere la terapia antidolorifica. I modelli OA sono stati classicamente suddivisi in modelli spontanei e indotti. I modelli spontanei includono modelli naturali e modelli geneticamente modificati, che possono simulare più da vicino il decorso dell'OA primaria nell'uomo8. I modelli indotti possono generalmente essere suddivisi in due categorie: 1) OA post-traumatica indotta da chirurgia o altri traumi; o 2) iniezione intra-articolare di sostanze condrotossiche o pro-infiammatorie3. Questi modelli gettano le basi per lo studio fisiopatologico dell'OA e contribuiscono notevolmente allo sviluppo di farmaci per ridurre il dolore e aumentare la funzione.
Recentemente, l'induttore più utilizzato per la modellazione OA è il mono-iodoacetato (MIA). MIA, un inibitore della gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi, può causare cambiamenti nella matrice della cartilagine, degradazione, perdita di cartilagine, sinovite e altri cambiamenti, che sono simili ai cambiamenti patologici dell'osteoartrite umana9. È stato notato che l'iniezione intra-articolare di MIA ha indotto dolore continuo a 28 giorni dopo la somministrazione di MIA, indicando che il modello MIA può essere utile per studiare il dolore nocicettivo cronico10,11,12. In questo studio, i ratti maschi di Sprague-Dawley hanno ricevuto iniezioni intra-articolari con 0,5, 1,5 o 3 mg di MIA nelle articolazioni del ginocchio. La gravità del dolore articolare indotto da MIA è stata misurata mediante valutazione della sensibilità meccanica e termica a 1, 7, 14, 21, 28 e 35 giorni dopo le iniezioni. Su questa base, 1,5 mg di MIA è stata selezionata come concentrazione finale per valutare i modelli di andatura e i cambiamenti istologici a 28 giorni dopo le iniezioni.

<table><tbody><tr><td>Anti-Collagen II antibody</td><td>Abcam(UK)</td><td>34712</td><td>Primary antibody for immunohistochemistry (IHC)</td></tr><tr><td>Anti-Collagen X (Col10) antibody</td><td>Abcam(UK)</td><td>49945</td><td>Primary antibody for IHC</td></tr><tr><td>DigiGait Imaging System</td><td>Mouse Specifics (Boston, MA, USA)</td><td></td><td>Equipment for gait patterns analyses</td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>861006</td><td>The dye for HE staining</td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252</td><td>The dye for SO staining</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse antibody</td><td>ZSGQ-BIO (Beijing, China)</td><td>PV-9002</td><td>Secondary antibody for IHC</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit antibody</td><td>ZSGQ-BIO (Beijing, China)</td><td>PV-9001</td><td>Secondary antibody for IHC</td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3163</td><td>The dye for HE staining</td></tr><tr><td>MIA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I4386-10G</td><td>powder</td></tr><tr><td>MMP13</td><td>Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA)</td><td>69926</td><td>Primary antibody for IHC</td></tr><tr><td>Modular tissue embedding center</td><td>Thermo Fisher Scientific (USA)</td><td>EC 350</td><td>Produce paraffin blocks.</td></tr><tr><td>Plantar Test apparatus</td><td>UgoBasile (Italy)</td><td>37370</td><td>Equipment for TWL assay</td></tr><tr><td>PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time)</td><td>TaKaRa Biotechnology Co. Ltd. (Dalian, China)</td><td>RR037A</td><td>Extracte total RNA from cultured cells</td></tr><tr><td>Rotary and Sliding Microtomes</td><td>Thermo Fisher Scientific (USA)</td><td>HM325</td><td>Precise paraffin sections.</td></tr><tr><td>Safranin-O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2255</td><td>The dye for SO staining</td></tr><tr><td>Tissue-Tek VIP 5 Jr</td><td>Sakura (Japan)</td><td></td><td>Vacuum Infiltration Processor</td></tr></tbody></table>

osteoarthritis pain model induced by intra-articular injection of mono-iodoacetate in rats

Gli attuali modelli animali di osteoartrite (OA) possono essere suddivisi in modelli spontanei e modelli indotti, entrambi i quali mirano a simulare i cambiamenti fisiopatologici dell'OA umana. Tuttavia, come sintomo principale nella fase avanzata dell'OA, il dolore influisce sulla vita quotidiana dei pazienti e non ci sono molti modelli disponibili. Il modello indotto da mono-iodoacetato (MIA) è il modello di dolore OA più utilizzato, utilizzato principalmente nei roditori. MIA è un inibitore della gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi, che causa morte dei condrociti, degenerazione della cartilagine, osteofiti e cambiamenti misurabili nel comportamento animale. Inoltre, nel modello indotto da MIA possono essere rilevate alterazioni dell'espressione della metalloproteinasi della matrice (MMP) e citochine pro-infiammatorie (IL1 β e TNF α). Questi cambiamenti sono coerenti con le condizioni fisiopatologiche di OA negli esseri umani, indicando che la MIA può indurre un modello di dolore OA misurabile e di successo. Questo studio mira a descrivere la metodologia di iniezione intra-articolare di MIA nei ratti e discutere i conseguenti comportamenti correlati al dolore e i cambiamenti istopatologici.

Con questa metodologia, abbiamo stabilito un modello di dolore OA nel ratto e rilevato i cambiamenti risultanti. MWT e TWL riflettevano rispettivamente l'allodinia meccanica e l'iperalgesia termica. Come mostrato in Figura 1, MIA ha indotto allodinia meccanica e iperalgesia termica presente in modo dose-dipendente. Sorprendentemente, la diminuzione della MWT ha raggiunto un picco da 21 giorni a 28 giorni, e poi è rimbalzata, suggerendo che la riparazione articolare può verificarsi in quest...

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Osteoarthritis Pain Model Induced by Intra-Articular Injection of Mono-Iodoacetate in Rats

Questo studio descrive il metodo di iniezione intra-articolare di mono-iodoacetato nei ratti e discute i comportamenti correlati al dolore risultanti e i cambiamenti istopatologici, che forniscono riferimenti per applicazioni future.

Modello di dolore da osteoartrite indotto dall'iniezione intra-articolare di mono-iodoacetato nei ratti

The current animal models of osteoarthritis (OA) can be divided into spontaneous models and induced models, both of which aim to simulate the ...

osteoarthritis-pain-model-induced-intra-articular-injection-mono

Research

JoVE Journal

Medicine

8.1K Views.  Zhejiang Chinese Medical University. Questo studio descrive il metodo di iniezione intra-articolare di mono-iodoacetato nei ratti e discute i comportamenti correlati al dolore risultanti e i cambiamenti istopatologici, che forniscono riferimenti per applicazioni future.

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Chronic Constriction of the Sciatic Nerve and Pain Hypersensitivity Testing in Rats

Chronic neuropathic pain, resulting from damage to the central or peripheral nervous system, is a prevalent and debilitating condition, affecting 7-18% of the population1,2. Symptoms include spontaneous (tingling, burning, electric-shock like) pain, dysaesthesia, paraesthesia, allodynia (pain resulting from normally non-painful stimuli) and hyperalgesia (an increased response to painful stimuli). The sensory symptoms are co-morbid with behavioural disabilities, such as insomnia and depression. To study chronic neuropathic pain several animal models mimicking peripheral nerve injury have been developed, one of the most widely used is Bennett and Xie's (1988) unilateral sciatic nerve chronic constriction injury (CCI)3 (Figure 1). Here we present a method for performing CCI and testing pain hypersensitivity.
CCI is performed under anaesthesia, with the sciatic nerve on one side exposed by making a skin incision, and cutting through the connective tissue between the gluteus superficialis and biceps femoris muscles. Four chromic gut ligatures are tied loosely around the sciatic nerve at 1 mm intervals, to just occlude but not arrest epineural blood flow. The wound is closed with sutures in the muscle and staples in the skin. The animal is then allowed to recover from surgery for 24 hrs before pain hypersensitivity testing begins.
For behavioural testing, rats are placed into the testing apparatus and are allowed to habituate to the testing procedure. The area tested is the mid-plantar surface of the hindpaw (Figure 2), which falls within the sciatic nerve distribution. Mechanical withdrawal threshold is assessed by mechanically stimulating both injured and uninjured hindpaws using an electronic dynamic plantar von Frey aesthesiometer or manual von Frey hairs4. The mechanical withdrawal threshold is the maximum pressure exerted (in grams) that triggers paw withdrawal. For measurement of thermal withdrawal latency, first described by Hargreaves et al (1988), the hindpaw is exposed to a beam of radiant heat through a transparent glass surface using a plantar analgesia meter5,6. The withdrawal latency to the heat stimulus is recorded as the time for paw withdrawal in both injured and uninjured hindpaws. Following CCI, mechanical withdrawal threshold, as well as thermal withdrawal latency in the injured paw are both significantly reduced, compared to baseline measurements and the uninjured paw (Figure 3). The CCI model of peripheral nerve injury combined with pain hypersensitivity testing provides a model system to investigate the effectiveness of potential therapeutic agents to modify chronic neuropathic pain. In our laboratory, we utilise CCI alongside thermal and mechanical sensitivity of the hindpaws to investigate the role of neuro-immune interactions in the pathogenesis and treatment of neuropathic pain.

Due to the simplicity of surgery and the robust behavioural outcome, chronic constriction of the sciatic nerve is one of the pre-eminent animal models of neuropathic pain. Within 24 hrs following surgery, pain hypersensitivity is established and can be quantitatively measured using a von Frey aesthesiometer (mechanical test) and plantar analgesia meter (thermal test).

La costrizione cronica del nervo sciatico e Ipersensibilità Testing Pain in Rats

Chronic neuropathic pain, resulting from damage to the central or peripheral nervous system, is a prevalent and debilitating condition, affecting 7-18% of ...

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Medicina

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the occurrence of subretinal hemorrhage can affect photoreceptor cell death in the detached retina. Hence, it is advantageous to create reproducible RDs without subretinal hemorrhage for evaluating photoreceptor cell death. We modified a previously reported method to create bullous and persistent RDs in a reproducible location with rare occurrence of subretinal hemorrhage. The critical step of this modified method is the creation of a self-sealing scleral incision, which can prevent leakage of sodium hyaluronate after injection into the subretinal space. To make the self-sealing scleral incision, a scleral tunnel is created, followed by scleral penetration into the choroid with a 30 G needle. Although choroidal hemorrhage may occur during this step, astriction with a surgical spear reduces the rate of choroidal hemorrhage. This method allows a more reproducible and reliable model of photoreceptor death in diseases that involve RD such as rhegmatogenous RD, retinopathy of prematurity, diabetic retinopathy, central serous chorioretinopathy, and age-related macular degeneration (AMD).

Creating experimental retinal detachments with a reproducible and sustained height of detachment, and without subretinal hemorrhage, is important for studying the pathophysiology of photoreceptor cell loss in retinal disease and evaluating potential therapeutic interventions. Here, we report such a method in detail.

Distacco della retina Modello in Roditori da iniezione sottoretinico di ialuronato di sodio

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Experimental Glaucoma Induced by Ocular Injection of Magnetic Microspheres

Progress in understanding the pathophysiology, and providing novel treatments for glaucoma is dependent on good animal models of the disease. We present here a protocol for elevating intraocular pressure (IOP) in the rat, by injecting magnetic microspheres into the anterior chamber of the eye. The use of magnetic particles allows the user to manipulate the beads into the iridocorneal angle, thus providing a very effective blockade of fluid outflow from the trabecular meshwork. This leads to long-lasting IOP rises, and eventually neuronal death in the ganglion cell layer (GCL) as well as optic nerve pathology, as seen in patients with the disease. This method is simple to perform, as it does not require machinery, specialist surgical skills, or many hours of practice to perfect. Furthermore, the pressure elevations are very robust, and reinjection of the magnetic microspheres is not usually required unlike in some other models using plastic beads. Additionally, we believe this method is suitable for adaptation for the mouse eye.

We present a method for inducing elevated intraocular pressure (IOP), by injecting magnetic microspheres into the rat eye, to model glaucoma. This leads to strong pressure rises, and extensive neuronal death. This protocol is easy to perform, does not require repeat injections, and produces stable long-lasting IOP rises.

Experimental Glaucoma indotta da iniezione oculare di microsfere magnetiche

Progress in understanding the pathophysiology, and providing novel treatments for glaucoma is dependent on good animal models of the disease. We present ...

Inflammatory TMJ Pain Mouse Model: Bite Force and Von Frey Filament Assessments

Temporomandibular Joint Pain Measurement by Bite Force and Von Frey Filament Assays in Mice

Temporomandibular joint (TMJ) pain and osteoarthritis (OA) are common and debilitating disorders that impair patients' quality of life. The mechanisms driving diseases-related pain are poorly understood, and current treatments fail to provide effective and long-term therapeutic effects. Additionally, pain assessment in research, particularly orofacial pain, poses several challenges that complicate studies in both clinical and basic science settings. Therefore, we have established an inflammatory TMJ pain mouse model via intra-articular injection of CFA (Complete Freund's Adjuvant) and evaluated pain behaviors by bite force measurement and the von Frey filament test. Mice with CFA injection exhibited orofacial pain behaviors compared to PBS injection, including reduced bite force and head withdrawal threshold in the von Frey filament test. These methods are relatively easy to execute to have reproducible results and can be potentially extended to pain studies for other disease models related to TMJ disorders. Together, bite force, and the von Frey filament tests are reliable in measuring orofacial pain, as demonstrated in CFA injection-induced painful TMJOA mouse models.

This protocol describes how measuring bite force and head withdrawal threshold can capture pain behavior in Complete Freund's Adjuvant (CFA)-induced inflammatory temporomandibular joint (TMJ) pain.

Temporomandibular joint (TMJ) pain and osteoarthritis (OA) are common and debilitating disorders that impair patients' quality of life. The mechanisms ...

Comportamento

The Monoiodoacetate Model of Osteoarthritis Pain in the Mouse

A major symptom of patients with osteoarthritis (OA) is pain that&#160;is triggered by peripheral as well as central changes within the pain pathways. The current treatments for OA pain such as NSAIDS or opiates are neither sufficiently effective nor devoid of detrimental side effects. Animal models of OA are being developed to improve our understanding of OA-related pain mechanisms and define novel pharmacological targets for therapy. Currently available models of OA in rodents include surgical and chemical interventions into one knee joint. The monoiodoacetate (MIA) model has become a standard for modelling joint disruption in OA in both rats and mice. The model, which is easier to perform in the rat, involves injection of MIA into a knee joint that induces rapid pain-like responses in the ipsilateral limb, the level of which can be controlled by injection of different doses. Intra-articular injection of MIA disrupts chondrocyte glycolysis by inhibiting glyceraldehyde-3-phosphatase dehydrogenase and results in chondrocyte death, neovascularization, subchondral bone necrosis and collapse, as well as inflammation. The morphological changes of the articular cartilage and bone disruption are reflective of some aspects of patient pathology. Along with joint damage, MIA injection induces referred mechanical sensitivity in the ipsilateral hind paw and weight bearing deficits that are measurable and quantifiable. These behavioral changes resemble some of the symptoms reported by the patient population, thereby validating the MIA injection in the knee as a useful and relevant pre-clinical model of OA pain.
The aim of this article is to describe the methodology of intra-articular injections of MIA and the behavioral recordings of the associated development of hypersensitivity with a mind to highlight the necessary steps to give consistent and reliable recordings.

Osteoarthritis (OA), or degenerative joint disease, is a debilitating condition associated with pain that remains only partially controlled by available analgesics. Animal models are being developed to improve our understanding of OA-related pain mechanisms. Here we describe the methodology for the monoiodoacetate model of OA pain in the mouse.

Il modello Monoiodoacetate di osteoartrite Pain in the mouse

A major symptom of patients with osteoarthritis (OA) is pain that&#160;is triggered by peripheral as well as central changes within the pain pathways. The ...

A Model of Glaucoma Induced by Circumlimbal Suture in Rats and Mice

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known risk factor for glaucoma. This protocol demonstrates a step-by-step guide on this technique in Long Evans rats and C57BL/6 mice. Under general anesthesia, a "purse-string" suture is applied on the conjunctiva, around the equator and behind the limbus of the eye. The fellow eye serves as an untreated control. Over the duration of our study, which was a period of 8 weeks for rats and 12 weeks for mice, IOP remained elevated, as measured regularly by rebound tonometry in conscious animals without topical anesthesia. In both species, the sutured eyes showed electroretinogram features consistent with preferential inner retinal dysfunction. Optical coherence tomography showed selective thinning of the retinal nerve fiber layer. Histology of the rat retina in cross-section found reduced cell density in the ganglion cell layer, but no change in other cellular layers. Staining of flat-mounted mouse retinae with a ganglion cell specific marker (RBPMS) confirmed ganglion cell loss. The circumlimbal suture is a simple, minimally invasive and cost-effective way to induce ocular hypertension that leads to ganglion cell injury in both rats and mice.

Chronic ocular hypertension is induced by applying a circumlimbal suture in rats and mice, leading to functional and structural deterioration of the retinal ganglion cells consistent with glaucoma.

Un modello del Glaucoma indotto da sutura Circumlimbal nei ratti e nei topi

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known ...

Spontaneous and Evoked Measures of Pain in Murine Models of Monoarticular Knee Pain

Pain is the main cause of disability from arthritis. There is currently an unmet need for adequate treatments for arthritis pain. Pre-clinical models are necessary and useful for studying the mechanisms of pain and for evaluating efficacy of arthritis therapies. Measuring pain in animal models of arthritis is challenging. We have developed methods for measuring evoked and spontaneous pain in three models of murine arthritis. We quantitate the evoked pain responses of mice subjected to firm palpation of a painful knee. We also evaluate spontaneous pain by the proportion of weight and the amount of time placed on each of their 4 limbs after induction of arthritis pain in one knee. Joint pain in these mouse models produces a significant increase in evoked pain responses and an alteration in weight bearing. Since mice are quadrupeds, they offload the painful limb to the contralateral limb, to the forelimbs, or some combination. These methods are simple, require minimal equipment, and are reproducible and sensitive for detecting pain. They are useful for studying both disease-modifying arthritis treatments and analgesics in mice.

We have developed an evoked measure of arthritis pain and coupled it with a standardized method for measuring spontaneous pain in different murine models of chemically induced arthritis. These measures are sensitive and reproducible for different types of joint pain.

Spontanee ed evocate misure di dolore in modelli murini di dolore del ginocchio Monoarticular

Pain is the main cause of disability from arthritis. There is currently an unmet need for adequate treatments for arthritis pain. Pre-clinical models are ...

The Lower Body Positive Pressure Treadmill for Knee Osteoarthritis Rehabilitation

Here, based on a clinician&rsquo;s point-of-view, we propose a two-model lower body positive pressure (LBPP) protocol (walking and squatting models) in addition to a clinical, functional assessment methodology, including details for further encouragement of the development of non-drug surgical intervention strategies in knee osteoarthritis patients. However, we only present the effect of LBPP training in improvement of pain and knee function in one patient through three-dimensional gait analysis. The exact, long-term effects of this approach should be explored in future studies.

Here, based on a clinician&#8217;s point-of-view, we propose a two-model lower body positive pressure (LBPP) protocol (walking and squatting models) in addition to a clinical, functional assessment methodology, including details for further encouragement of the development of non-drug surgical intervention strategies in knee osteoarthritis patients. However, we only present the effect of LBPP training in improvement of pain and knee function in one patient through three-dimensional gait analysis. The exact, long-term effects of this approach should be explored in future studies.

Il tapis roulant a pressione positiva del corpo inferiore per la riabilitazione dell'osteoartrite del ginocchio

Here, based on a clinician&rsquo;s point-of-view, we propose a two-model lower body positive pressure (LBPP) protocol (walking and squatting models) in ...

Istituzione del modello KOA nei conigli utilizzando il metodo Videman modificato

Application of Acupotomy in a Knee Osteoarthritis Model in Rabbit

Knee osteoarthritis (KOA) is one of the most frequently encountered diseases in the orthopedic department, which seriously reduces the quality of life of people with KOA. Among several pathogenic factors, the biomechanical imbalance of the knee joint is one of the main causes of KOA. Acupotomology believes that restoring the mechanical balance of the knee joint is the key to treating KOA. Clinical studies have shown that acupotomy can effectively reduce pain and improve knee mobility by reducing adhesion, contracture of soft tissues, and stress concentration points in muscles and tendons around the knee joint. 
In this protocol, we used the modified Videman method to establish a KOA model by immobilizing the left hindlimb in a straight position. We have outlined the method of operation and the precautions related to acupotomy in detail and evaluated the efficacy of acupotomy in conjunction with the theory of "Modulating Muscles and Tendons to Treat Bone Disorders" through the detection of the mechanical properties of quadriceps femoris and tendon, as well as cartilage mechanics and morphology. The results show that acupotomy has a protective effect on cartilage by adjusting the mechanical properties of the soft tissues around the knee joint, improving the cartilage stress environment, and delaying cartilage degeneration.

Autore in primo piano: Indagine sul meccanismo d'azione dell'acupotomia nel trattamento dell'osteoartrosi del ginocchio

In this protocol, a knee osteoarthritis model was prepared using the modified Videman method, and the operation procedures and precautions of acupotomy are detailed. The effectiveness of acupotomy has been demonstrated by testing the mechanical properties of quadriceps femoris and tendon and the mechanical and morphological properties of cartilage.

Applicazione dell'agopotomia in un modello di osteoartrite del ginocchio nel coniglio

Knee osteoarthritis (KOA) is one of the most frequently encountered diseases in the orthopedic department, which seriously reduces the quality of life of ...

Modello di dolore da osteoartrite indotto dall'iniezione intra-articolare di mono-iodoacetato nei ratti

Riepilogo

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Capitoli in questo video

La costrizione cronica del nervo sciatico e Ipersensibilità Testing Pain in Rats

Distacco della retina Modello in Roditori da iniezione sottoretinico di ialuronato di sodio

Experimental Glaucoma indotta da iniezione oculare di microsfere magnetiche

Temporomandibular Joint Pain Measurement by Bite Force and Von Frey Filament Assays in Mice

Il modello Monoiodoacetate di osteoartrite Pain in the mouse

Un modello del Glaucoma indotto da sutura Circumlimbal nei ratti e nei topi

Spontanee ed evocate misure di dolore in modelli murini di dolore del ginocchio Monoarticular

Il tapis roulant a pressione positiva del corpo inferiore per la riabilitazione dell'osteoartrite del ginocchio

Applicazione dell'agopotomia in un modello di osteoartrite del ginocchio nel coniglio

Applicazione dell'agopotomia in un modello di osteoartrite del ginocchio nel coniglio