Questo metodo consente di analizzare la barriera ematico-encefalica umana misurando la traversata batterica su diversi trattamenti. Può aiutare a scoprire la patogenesi della meningite batterica e delirio postoperatorio. È un metodo semplice e gli effetti del trattamento sono direttamente rappresentati dal numero di batteri.
Può essere modificato per consentire un'analisi ad alta produttività dei composti sulle cellule endoteliali. Inizia assemblando la piastra da 12 po 'in un armadietto di sicurezza biologico. Spacchettare la piastra e ogni inserto, quindi utilizzare le forcep sterilizzate per afferrare gli inserti alla loro base e metterli nei pozzi.
Rivestire la membrana porosa di ogni inserto con 90 microlitri di 10 microgrammi per microlitro collagene IV e miscela di fibronectina e incubare la piastra in un incubatore di coltura cellulare a 37 gradi Celsius per 24 ore. Dopo l'incubazione, lavare gli inserti due volte pipettando un millilitro di PBS in ogni inserto e aspirarlo con una pompa per vuoto. Quindi equilibrare le membrane pipettando il mezzo DMEM F12 prebellico nelle camere superiore e inferiore e incubare la piastra a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.
Per seminare le cellule endoteliali microvascolari umane, aspirare il mezzo dal pallone di coltura cellulare e lavare le cellule con 10 millilitri di PBS. Coprire completamente le cellule con cinque millilitri di EDTA di tripside e incubare il pallone per tre o cinque minuti a 37 gradi Celsius. Trasferire cinque millilitri delle cellule in un tubo da 15 millilitri e aggiungere cinque millilitri di FCS contenenti mezzo per fermare la reazione enzimatica.
Centrifugare la sospensione per tre minuti a 210 volte g, rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in cinque millilitri di mezzo. Aggiungere 10 microlitri della sospensione cellulare a 10 microlitri dello 0,4% di macchia blu trypan, quindi aggiungere 10 microlitri della miscela a una camera di conteggio. Mettere la camera di conteggio nel contatore della cella e avviare il programma appropriato assicurandosi che il contatore sia focalizzato.
Dopo il conteggio, seminare 200.000 cellule in ogni camera superiore sulla piastra da 12 pozzi e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 14 giorni cambiando il supporto nella camera superiore e inferiore ogni due o tre giorni. Dopo 14 giorni, assicurarsi che la confluenza cellulare sia al 100% imaging con un microscopio. Un giorno prima della misurazione della permeabilità, mettere una colonia di ceppo E.coli GM2163 in tre millilitri di mezzo LB.
Coltura delle cellule a 37 gradi Celsius per 24 ore in uno shaker di incubazione. Per trattare le cellule con un composto di interesse, diluirlo alla sua concentrazione finale nel mezzo DMEM F12 e aggiungere questa miscela nelle camere superiore e inferiore nella piastra da 12 po ', quindi incubare la piastra in un incubatore di coltura cellulare. Dopo l'incubazione, scambiare il mezzo completo con un mezzo privo di antibiotici.
Determinare la concentrazione della coltura batterica durante la notte misurando la sua densità ottica a 600 nanometri, quindi diluirla in un OD600 di 0,5 in un tubo Falcon da 50 millilitri. In un armadio di sicurezza biologico, aggiungere 450 microlitri della soluzione batterica in ogni camera superiore della piastra da 12 po ', quindi incubare la piastra per sei ore a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, rimuovere l'inserto con le forcep e campionare 50 microlitri del mezzo da ogni camera inferiore facendo attenzione a non versare il mezzo dalle camere superiori in quelle inferiori.
È importante separare rigorosamente i supporti della camera superiore e inferiore poiché una fuoriuscita dai batteri della camera superiore porterebbe a risultati falsi positivi. Far cadere ogni campione su una piastra di agar separata e striature la soluzione con uno spargitore di cellule. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 24 ore, quindi contare le colonie.
Per studiare l'effetto della glicazione sull'attraversamento microbico attraverso la barriera ematica- encefalica, le cellule sono state trattate con una soluzione glimosale da 0,5 e 0,15 millimolare per un'ora con cellule non trattate che fungono da controllo. La glicazione è stata quindi rilevata tramite immunoblotting con anticorpi anti-AGE. Le colonie batteriche ottenute furono contate e rappresentate come il numero assoluto di colonie o il numero relativo di colonie normalizzate al controllo.
Campioni trattati con glioxale mostravano un numero maggiore di colonie che indicavano che il trattamento ha un effetto sulla densità della barriera cellulare. Per studiare la glicazione proteica indotta dal glucosio, i THBMEC sono stati coltivati in glucosio normale e mezzo di glucosio elevato. Il numero assoluto di colonie e il numero relativo di colonie normalizzate al controllo indicavano che il glucosio non aveva alcun effetto significativo sull'integrità della barriera ematico-encefalica.
Le cellule endoteliali trattate possono essere ulteriormente analizzate mediante approcci proteomici, ad esempio la spettrometria di massa, per analizzare i cambiamenti nel proteoma. Questa tecnica aiuta a comprendere la barriera ematico-encefalica umana e il traverso batterico. Può essere utilizzato per scoprire aspetti dell'invecchiamento e malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer.
