Questo lavoro è stato sostenuto dal Centro Interdisciplinare per la Ricerca Clinica (IZKF) Münster (SEED 03/12, SB), dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), Celle-in-Motion Cluster of Excellence (EXC 1003 - CIM), Università di Muenster (a SB e SGM) e dalla Else Kröner-Fresenius-Stiftung (2012_A88 a SB e SGM). Ringraziamo Heike Blum per le ottime illustrazioni.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dalle autorità locali (&quot;LandesamtfürNatur, Umwelt und Verbraucherschutz NRW, Fachbereich 87, Tiergesundheit, Tierschutz, Recklinghausen, Germania&quot;) e condotto secondo la legge tedesca di protezione degli animali. 1. Osservazioni generali per esperimenti mouse <ol><li> Eseguire tutti gli esperimenti con i topi in conformità con le linee guida del rispettivo Comitato Istituzionale cura degli animali e l&#39;uso. </li><li> Tenere i topi in condizioni esenti da organismi patogeni e consentire loro di avere accesso a cibo e acqua ad libitum. </li><li> Utilizzare i topi per età e sesso nei gruppi trattati perché le proprietà biologiche può variare con l&#39;età e il sesso. </li><li> Per quanto possibile cercare di ridurre, perfezionare o sostituire gli esperimenti sugli animali. </li></ol> 2. Preparazione del gradiente Percoll <ol><li> Mescolare 19 ml di PBS 1x con 1 ml di PBS 10x, 1 ml FCS e 10 ml di Percoll. </li><li> Eseguire sterile filtrazione in un tubo di vetro (diametro dei pori del filtro: 0,2 micron). Successivamente conservare la soluzione a 4 ° C. </li></ol> 3. Preparazione del mezzo endotelio cellulare e rivestimento delle piastre di coltura cellulare <ol><li> Media delle cellule endoteliali: <ol><li> Preparazione del mezzo 500 ml: (. Circa 20%) Miscelare 400 ml di terreno DMEM (. Circa 80%) con 100 ml PDS, 0,25 ml bFGF (. 20 ug / ml, circa 0,05%), 0,5 ml di eparina (100 microlitri / mi;. circa 0,1%) e 0,5 ml pyrumycin (4 mg / ml;. circa 0,1%). Aggiungere pyrumycin solo per mezzo di coltura cellulare usato nei primi 2 giorni di coltura. </li><li> Eseguire filtrazione sterile in un tubo di vetro (diametro dei pori del filtro: 0,2 micron). Successivamente conservare la soluzione a 4 ° C. </li></ol></li><li> Rivestimento di piastre di colture cellulari: <ol><li> Ad 1 ml di soluzione di rivestimento, preparare una soluzione di 500 microlitri DDH 2 O, 400 microlitri collagene IV (0,4 mg / ml) e 100 ml di fibronectina (0,1 mg / ml). </li><li> Coprire tutta la superficie di each pozzetto della piastra di coltura cellulare con la soluzione di rivestimento. Conservare la piastra a 4 ° C per una notte. </li></ol></li></ol> 4. L&#39;isolamento di cellule endoteliali murine Cervello microvascolari (MBMEC) <ol><li> Sacrifica 10 topi adulti (8 - 12 settimane di vita, C57BL / 6) per dislocazione cervicale. Successivamente isolare i mouse-cervello e conservare in 5 ml di PBS (Caveat: lavoro sterile). </li><li> Rimuovere cervello steli, cerebella e talami con una pinza. Staccare meningi facendo rotolare con cura il cervello su una carta assorbente sterile. Raccogliere le conseguenti free-meningi forebrains. </li><li> Trasferire il cervello di un tubo da 50 ml Falcon riempito con 13,5 ml di DMEM. </li><li> Macinare il tessuto, prima con una pipetta 25 ml, poi con una pipetta 10 ml fino alla media diventa lattiginoso. </li><li> Poi digerire il tessuto con una miscela di 0,6 ml di collagenasi CLS2 (10 mg / ml in DMEM) e 0,2 ml di DNAsi (1 mg / ml in PBS) a Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) per 1 ora a 37 ° C su un orbitale scuoterer a 180 rpm. </li><li> Aggiungere 10 ml di DMEM aggiunti alla sospensione di tessuto e centrifugare le cellule a 1.000 xg per 10 min a 4 ° C. </li><li> Eliminare il surnatante (Caveat: PELLET è facile perdere) </li><li> Per rimuovere la mielina, risospendere il pellet con una pipetta 25 ml in 25 ml di BSA-DMEM (20% w / v) (circa. 25 volte), e centrifugare a 1000 xg per 20 min a 4 ° C. </li><li> Eliminare lo strato di mielina superiore (latte) con una rotta pipetta Pasteur di vetro con diametro maggiore, e quindi eliminare lo strato di BSA con una normale pipetta Pasteur. </li><li> Risospendere il pellet in 9 ml di DMEM ed aggiungere 1 ml di collagenasi / dispasi (concentrazione finale di 1 mg / ml) e 0,1 ml di DNAsi. Digerire la soluzione per 1 ora a 37 ° C in un agitatore orbitale a 180 giri al minuto (avvertimento: non utilizzare la pipetta per sospendere di nuovo - le cellule possono essere persi). </li><li> Durante la digestione, centrifugare la soluzione Percoll per impostare il gradiente di densità utilizzando un&#39;ultracentrifuga a 3.000 xg per 1 ora a 4 ° C, con accelerazione, wisarie, senza freno. </li><li> Aggiungere 10 ml di DMEM alla sospensione cellulare digerito. Centrifugare la sospensione a 1000 xg per 10 min a 4 ° C. Poi scartare il surnatante e risospendere il pellet in 2 ml di DMEM. </li><li> Aggiungere le cellule risospese attenzione sulla parte superiore del gradiente di Percoll e centrifugare a 700 xg per 10 min a 4 ° C senza accelerazione e frenatura. Nota: Le celle sono visibili come una nuvola in interfase. </li><li> Prendete circa. 12 ml di interfase con le cellule con un lungo ago sterile e posizionarlo in una nuova Falcon da 50 ml con 5 ml di DMEM. </li><li> Centrifugare le cellule di nuovo a 1000 xg per 10 min a 4 ° C. Successivamente risospendere il pellet in mezzo delle cellule endoteliali (utilizzare circa. 0,2 ml di terreno per 1 cm 2 di superficie della piastra di coltura cellulare). </li><li> Rimuovere la soluzione di rivestimento da piastre di coltura di cellule rivestite (vedere il punto 3.2) e sciacquare ogni bene con PBS sterile in due fasi di lavaggio consecutive. </li><li> Mantenere colture cellulari in endotelialemedio cella a 37 ° C e 5% di CO 2 in un incubatore sterile. Cambiare la media ogni due o tre giorni. Celle divise al 90% di confluenza. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Disfunzioni emato-encefalica-barriera è un marchio di garanzia di varie malattie deleteri sul sistema nervoso centrale, ad esempio una ripartizione della BBB nella sclerosi multipla facilita ampiamente l&#39;invasione del sistema nervoso centrale da parte delle cellule immunitarie autoreattive e permette l&#39;incontro e la distruzione degli oligodendrociti. In ictus ischemico l&#39;interruzione della BBB e la successiva formazione di edema cerebrale sono fattori critici che influenzano la crescita infarto secondario e la sopravvivenza globale dei pazienti 6. Inoltre, da alterazioni della BBB in aree remote lesioni ischemiche focali sono in grado di indurre diffuse alterazioni funzionali del cervello. Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base sono in gran parte sconosciuti 5. Al contrario, l&#39;alta densità e la diversità dei trasportatori di efflusso in BMECs funzionali riduce la concentrazione di farmaci benefici come chemioterapici per tumori maligni del cervello o di antibiotici per le malattie infettive. Di conseguenza, una più profonda comprensione del sangue-cervello-barÈ necessario rier funzione in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche per sviluppare agenti farmacologici in grado di regolare specificamente la funzione barriera nella direzione favorita 21. Affidabile in modelli in vitro di BBB sono strumenti indispensabili per lo studio dei meccanismi di regolamentazione a BBB. Molte linee di cellule endoteliali cerebrali immortalati sono stati stabiliti e impiegati come modelli in vitro di BBB 22. Queste linee cellulari offrono alcuni vantaggi rispetto BMECs primarie man mano che crescono più velocemente e mantengono alcune caratteristiche BBB nell&#39;arco di diversi passaggi. Tuttavia, le linee di cellule endoteliali non possono sostituire in toto per le cellule primarie proprietà come importanti sono modificati che si mescolano con la trasferibilità dei risultati sperimentali alla situazione in vivo. Ad esempio, la linea cellulare endoteliale cervello murino bEnd.5 esprime solo bassi livelli di proteine ​​di giunzione stretti discontinuo distribuiti portano a alto Paracpermeabilità ellular 23. BEnd.3, un&#39;altra linea di cellule murine endoteliali cerebrali di uso frequente, dimostra giunzioni densi e continui distribuiti stretti, una elevata resistenza transendoteliale, diversi trasportatori di efflusso e bassa permeabilità paracellulare. Tuttavia, strati cellulari bEND.3 confrontati BMECs primari mancano di una vera discriminazione rispetto alla permeazione di alcuni transcellulare e substrati paracellular 24. Nelle preparazioni di colture cellulari primarie, cellule contaminanti possono interferire in modo significativo con la validità dei risultati sperimentali. Nel protocollo descritto, pyrumicin viene usato come agente selettivo per cellule endoteliali di raggiungere elevata purezza. Tuttavia, un controllo regolare della qualità della coltura cellulare è inevitabilmente necessario per garantire per esperimenti affidabili. Ci sono diversi metodi per il controllo qualità, oltre a tipiche caratteristiche morfologiche delle cellule endoteliali (Figura 1A), il transendotheliaresistenza l può essere misurato o l&#39;espressione del marcatore delle cellule endoteliali come CD31 (Figura 1B) o il fattore di von Willebrand (vWF) potrebbe essere valutata. Il numero di cellule endoteliali cerebrali isolate da un cervello di topo è relativamente basso e di creare una coltura cellulare adeguata per più esperimenti, il cervello dei topi diversi devono essere messe in comune. Nella nostra esperienza, almeno 10 topi devono essere utilizzati per un esperimento che potrebbe essere un fattore limitante seconda delle risorse dei rispettivi stabulario. Al fine di evitare distorsioni o fattori confondenti, solo i topi con un background genetico e ambientale identiche dovrebbero essere messe in comune. Al contrario, bovini e preparazioni di cellule endoteliali cerebrali suine fornire un gran numero di cellule endoteliali cerebrali disponibili in un cervello. Tuttavia, oltre il semplice allevamento e l&#39;alloggiamento, il repertorio ampio e sempre crescente di topi transgenici rende disponibili murino primario BMECs come idealemodello per studiare la funzione emato-encefalica Barriera. Diversi risultati fondamentali riguardanti le funzioni del BBB e dei meccanismi molecolari alla base provengono da studi in sistemi di coltura di tessuti 2D. Recentemente, sistemi di coltura 3D sono stati sviluppati 25, in cui le cellule endoteliali sono collocati all&#39;interno di una matrice di collagene che consenta loro di formare lume e reti tubolari. Questi nuovi sistemi di coltura cellulare consentono una riproduzione ancora più precisa dei processi vascolari nell&#39;organismo integro in vivo. Il coinvolgimento di ulteriori cellule dei NVU in 3D sistemi di colture cellulari, come i periciti e astrociti potrebbe rivoluzionare in vitro studio della funzione emato-encefalica Barriera; primi modelli sono stati recentemente sviluppati 26. Ci sono alcune raccomandazioni per la risoluzione dei problemi. Innanzitutto lavoro sterile è essenziale per la qualità della coltura di cellule endoteliali. In secondo luogo, pyrumycin deve essere aggiunto solo per cellulareterreno di coltura utilizzato nei primi 2 giorni di coltura, l&#39;applicazione più lungo potrebbe portare ad un aumento della morte cellulare MBMEC e la funzione di barriera bassa qualità. In terzo luogo, gli enzimi applicati in questo protocollo devono essere utilizzati e conservati secondo le istruzioni del fabbricante; altrimenti la loro funzione potrebbe essere compromessa. Inoltre, il rivestimento delle piastre di coltura di cellule potrebbe essere modificata se le cellule endoteliali non attribuiscono. Le concentrazioni di fibronectina e collagene potrebbero essere modificati o altre proteine ​​della matrice possono essere aggiunti alla soluzione di rivestimento. Infine, l&#39;età, il sesso, la stagione delle condizioni anno e ambientali all&#39;interno della struttura degli animali sono fattori importanti che potrebbero influenzare la qualità di isolamento MBMEC e comparabilità degli esperimenti. Occorre garantire che le condizioni siano comparabili tra esperimenti indipendenti. Il protocollo descritto dovrebbe essere considerato come un metodo neuroimmunologica base per isolare BMECs murini. Le cellule isolate possono essere used per una vasta gamma di applicazioni per ottenere una visione più completa funzione BBB, come ad esempio test di migrazione, genetica e studi di espressione di proteine, valutazioni elettrofisiologiche o esperimenti di permeabilità. Come accennato in precedenza, i sistemi di coltura cellulare 3D di BMECs potrebbero fornire nuove opportunità per studiare i complessi meccanismi coinvolti nella regolazione della BBB nel contesto del NVU. Pertanto, l&#39;isolamento delle cellule endoteliali primarie rimarrà una tecnica prezioso nel campo della ricerca BBB in futuro.

<html> Cervello microvascolare cellule endoteliali (BMEC) formano monostrati che sono parte integrante della ematoencefalica barriera altamente specializzato (BBB). BMECs sono interconnessi da proteine ​​giunzionali attaccato ad una membrana basale. Insieme con periciti, cellule muscolari lisce, i piedi di fascia astrociti e cellule circolanti del sangue si accumulano i cosiddetti unità neurovascolare (NVU) 1. Contro il concetto precedente di una barriera impermeabile tra il sangue e il nervoso centrale (SNC), il NVU è un&#39;interfaccia dinamica, altamente specifico e regolato che controlla il passaggio di fluidi, molecole e cellule tra vasi sanguigni cerebrali e del SNC 2 . Una disfunzione o disregolazione del NVU possono avviare e / o contribuire ad una varietà di neurovascolari, malattie infettive, infiammatorie o degenerative del sistema nervoso centrale, come l&#39;ictus ischemico, l&#39;HIV-encefalopatia, la sclerosi multipla, il morbo di Alzheimer o di Parkinson malattia 3-6. _content &quot;&gt; Il monostrato BMEC è chiuso ermeticamente da un complesso giunzionale costituito di tenuta (TJ) e giunzioni aderenti (AJ) 7. L&#39;elevata resistenza elettrica e la bassa permeabilità paracellulare della BBB si basano principalmente sulle proteine ​​TJ 8. Le TJs sono complessi formati dalle proteine ​​transmembrana della famiglia Claudin e occludina, che sono collegati al citoscheletro delle cellule endoteliali da molecole adattatori, quali le zonulaoccludens (ZO) proteine ​​ZO1-3 4. giunzioni aderenti sono assemblati principalmente dalla proteina integrale di membrana vascolare endoteliale (VE) -cadherin, che è legata al citoscheletro tramite catenine 8. La stretta tenuta della BBB impedisce il libero scambio di substrati e cellule tra il sangue e nel liquor. Le eccezioni a questa regola sono lipofile, piccole molecole di peso molecolare &lt;400 Da, che sono in grado di attraversare la BBB da lipidica mediata diffusione 9. Il passaggio di grandi e / omolecole idrofile, come il glucosio, aminoacidi, peptidi, proteine ​​e molti farmaci è limitata a sistemi altamente controllati transcellulare di trasporto 10, che possono essere classificati in cinque categorie principali: trasporto carrier-mediato, trasporto di ioni, trasporti efflusso attivo, mediata da recettori trasporti, e caveole mediata trasporto 4. Questi sistemi trasportatori aiutano mantenere l&#39;omeostasi del sistema nervoso centrale, che è richiesto per una generazione del segnale accurata, trasduzione e integrazione. Inoltre, BMECs sono in grado di controllare attivamente il passaggio di molecole distinte mediante l&#39;espressione di una varietà di ectoenzimi. Questi enzimi sono localizzati sulla superficie cellulare e modificare substrati endogeni ed esogeni specifici impedire o consentire il passaggio della BBB 11. Considerando che il sistema nervoso centrale è stato considerato come un organo immunitario privilegiato per un lungo tempo, i recenti risultati suggeriscono un sistema piuttosto dinamico e strettamente regolamentato di Surv immunitarioeillance del SNC. I BMECs sono criticamente coinvolti nella regolazione della trasmigrazione delle cellule immunitarie. Con l&#39;espressione delle selectine sulle loro linfociti superficie selettivamente indotto a fissare liberamente per l&#39;endotelio. La secrezione di chemochine che incontrano con specifici recettori sui leucociti conduce all&#39;espressione o cambiamenti conformazionali di integrine leucocitarie, come LFA-1 (funzione associato al linfocita-1) e VLA-4 (molto tardi antigene-4). Le integrine mediano una ferma adesione legandosi loro counterreceptors endoteliali, ad esempio, VCAM-I (molecola di adesione delle cellule vascolari), ICAM-I (molecola di adesione intercellulare) che permettono la trasmigrazione nel parenchima cerebrale fra o attraverso BMECs della BBB 12-14. Questi e altri risultati sottolineano il ruolo attivo dell&#39;endotelio stesso nella regolazione della migrazione delle cellule immunitarie. Inoltre, BMECs come parte del NVU sono coinvolti nella regolazione del flusso ematico cerebrale linked alle richieste metaboliche neuronali locali. Dopo la stimolazione astrociti cellule endoteliali producono sostanze vasoattive come l&#39;ossido nitrico che porta al rilassamento delle cellule muscolari lisce vascolari 15. L&#39;angiogenesi e neurogenesi nella sviluppo e nell&#39;adulto mostra cervello patterning e sviluppo parallelo e condividere molte proprietà di regolazione 1, 4. Le cellule endoteliali sono criticamente coinvolte in questi processi 16, 17. In sintesi, BMECs fornire caratteristiche essenziali per garantire un corretto sviluppo e funzionamento del sistema nervoso centrale. La disfunzione BBB è legato a molti gravi disturbi neurologici. Tuttavia, solo pochi obiettivi sono stati identificati a livello di interfaccia cervello-vascolare per il trattamento specifico ed efficace 18. Semplificata in modelli in vitro sono stati utilizzati per comprendere i meccanismi coinvolti nella funzione e la regolazione di sistemi fisiologici complessi per lotempo ng. L&#39;isolamento come descritto da questo manoscritto e lo studio in vitro di murino BMECs, data la grande varietà di specifiche topo knockout-ceppi, potrebbe fornire una maggiore comprensione della funzione BBB e regolazione in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche aprono nuove strade terapeutiche.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="808">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">bFGF</td>
			<td style="width:133px;">Peprotech</td>
			<td style="width:123px;">100-18B</td>
			<td style="width:331px;">Basic fibroblast growth factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">BSA</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A9418</td>
			<td>Bovine serum albumine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Collagenase CLS2</td>
			<td style="width:133px;">Worthington</td>
			<td style="width:123px;">LS004176</td>
			<td>High relative level of protease activity</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Collagenase-dispase</td>
			<td style="width:133px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:123px;">10269638001</td>
			<td style="width:331px;">Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Collagen IV</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C0543</td>
			<td style="width:331px;">From Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">DMEM</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D5030</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">DNAse</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D4513</td>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">FCS</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">F6178</td>
			<td>Fetal calf serum (also named fetal bovine serum)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Heparin</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H3393</td>
			<td>Anticoagulant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">PDS</td>
			<td style="width:133px;">First Link UK Ltd.</td>
			<td style="width:123px;">60-00-850</td>
			<td>Plasma-derived serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Percoll</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P1644</td>
			<td>Warm to room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Pyrumycin</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P8833</td>
			<td>Should only be used in first 2 d of culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood. 
Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.
This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.

Subito dopo l&#39;isolamento, BMECs murine e cellule contaminanti formano conglomerati galleggianti nel mezzo di coltura cellulare (Figura 1A, giorno 0). Il trattamento con pyrumycin porta ad una selezione di BMECs murini quanto esprimono elevati livelli di trasportatori di efflusso quali la P-glicoproteina portando ad una relativa resistenza alle tossine. Cellule contaminanti sono molto più sensibili a pyrumycin citotossicità mediata 19. Durante il processo di selezione pyrumicin, cellule contaminanti entrano morte cellulare per apoptosi o necrosi, mentre MBMECs cominciano ad allegare al collagene IV / fibronectina rivestite con piastre di coltura cellulare (Figura 1A, il giorno 1 e il giorno 2). Fino al giorno 5, i MBMECs proliferano ad una densità di circa. 80-90%. Sono caratterizzati dal tipico aspetto a forma di fuso. Alla confluenza, formano un monostrato di contatto inibito cellule non sovrapposte ravvicinate, allineati longitudinalmente e (Figura 1A, il giorno 5). Daselezione pyrumicin, un&#39;elevata purezza di fino al 99% MBMEC è raggiunto come dimostra il marker endoteliale CD31 (PECAM1; Figura 1B). I MBMECs formano monostrati ben sigillati tra loro da proteine ​​di giunzione stretti. Dopo 7 - 8 giorni di coltura, gli strati di cellule endoteliali accumulano valori stabili per resistenza elettrica (raggiungendo valori tipici tra 20 - 30 che Ω x cm 2). E capacità (Figura 1C) A questo punto test funzionali quali cellulo esperimenti di migrazione 3, 20,21 e permeabilità test, ad esempio con il blu di Evans o destrano, devono essere eseguiti. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52204/52204fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. morfologiche e funzionali di Murine BMECs. (A) andamento temporale Rappresentante di BMECs coltivate visti di trasmissione della luce microSCOPY più di 5 giorni. Barra di scala vale per tutte le immagini. (B) colorazione immunofluorescenza per il marcatore delle cellule endoteliali CD31 al giorno 5. CD31 (verde) e DAPI (blu). (C) Le cellule sono state precultured per 5 giorni e poi trasferiti ad un sistema automatizzato per la analisi delle proprietà biofisiche (resistenza e capacità). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52204/52204fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.

Isolamento di cellule primarie murini cervello microvascolare endoteliali

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

isolation-of-primary-murine-brain-microvascular-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Neuroscience

32.0K Views.  University of Münster. Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB. 

Video: Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The blood-brain barrier (BBB) consisting of EC, astrocyte end-feet, pericytes and the basal membrane is responsible for the protection and homeostasis of the brain parenchyma. In vitro BBB models are common tools to study the structure and function of the BBB at the cellular level. A considerable number of different in vitro BBB models have been established for research in different laboratories to date. Usually, the cells are obtained from bovine, porcine, rat or mouse brain tissue (discussed in detail in the review by Wilhelm et al. 1). Human tissue samples are available only in a restricted number of laboratories or companies 2,3. While primary cell preparations are time consuming and the EC cultures can differ from batch to batch, the establishment of immortalized EC lines is the focus of scientific interest.
Here, we present a method for establishing an immortalized brain microvascular EC line from neonatal mouse brain. We describe the procedure step-by-step listing the reagents and solutions used. The method established by our lab allows the isolation of a homogenous immortalized endothelial cell line within four to five weeks. The brain microvascular endothelial cell lines termed cEND 4 (from cerebral cortex) and cerebEND 5 (from cerebellar cortex), were isolated according to this procedure in the F&ouml;rster laboratory and have been effectively used for explanation of different physiological and pathological processes at the BBB. Using cEND and cerebEND we have demonstrated that these cells respond to glucocorticoid- 4,6-9 and estrogen-treatment 10 as well as to pro-infammatory mediators, such as TNFalpha 5,8. Moreover, we have studied the pathology of multiple sclerosis 11 and hypoxia 12,13 on the EC-level. The cEND and cerebEND lines can be considered as a good tool for studying the structure and function of the BBB, cellular responses of ECs to different stimuli or interaction of the EC with lymphocytes or cancer cells.

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

This method describes how to isolate and immortalize microvascular endothelial cells from mouse brain. We describe a step-by-step protocol starting from the homogenization of brain tissue, digestion steps, seeding and immortalization of the cells. Usually, it takes about five weeks to obtain a homogenous, immortalized microvascular endothelial cell line.

Generazione di un immortalato Murine Linea microvascolare Brain Cell endoteliali come<em&gt; In Vitro</em&gt; Blood Cervello Modello barriera

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

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Neuroscienze

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

Isolamento e coltura di cellule endoteliali dal embrionali Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Isolamento, cultura e lungo termine Manutenzione di primaria mesencefalico neuroni dopaminergici Da Brains embrionali dei roditori

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

Immagini di corteccia cerebrale primario celle utilizzando un sistema 2D cultura dal vivo

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal muscles regulating the exchange of fluids and nutrients as well as the immune response against infectious agents by controlling immune cell migration. For these functions, MMEC form a functional &#34;myovascular unit&#34; (MVU), with further cell types, such as fibroblasts, pericytes and skeletal muscle cells. Consequently, a dysfunction of MMEC and therefore the MVU contributes to a vast variety of myopathies. However, regulatory mechanisms of MMEC in health and disease remain insufficiently understood and their elucidation precedes more specific treatments for myopathies. The isolation and in-depth investigation of primary MMEC functions in the context of the MVU might facilitate a better understanding of these processes.
This article provides a protocol to isolate primary murine MMEC of the skeletal muscle by mechanical and enzymatic dissociation including purification and culture maintenance steps.

Microvascular endothelial cells of skeletal muscles (MMEC) shape the inner wall of muscle capillaries and regulate both, exchange of fluids/molecules and migration of (immune) cells between muscle tissue and blood. Isolation of primary murine MMEC, as described here, enables comprehensive in vitro investigations of the &#34;myovascular unit&#34;.

Isolamento di cellule endoteliali microvascolari murino primario del muscolo scheletrico

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized niches in vivo and can be isolated and expanded in vitro, serving as an important resource for cell transplantation to repair brain damage. However, NSPCs are heterogeneous and not clearly defined at the molecular level or purified due to a lack of specific cell surface markers. The protocol presented, which has been previously reported, combines a neural-endothelial co-culture system with a metabolic glycan labeling method to identify the surface sialoglycoproteome of primary NSPCs. The NSPC-endothelial co-culture system allows self-renewal and expansion of primary NSPCs in vitro, generating a sufficient number of NSPCs. Sialoglycans in cultured NSPCs are labeled using an unnatural sialic acid metabolic reporter with bioorthogonal functional groups. By comparing the sialoglycoproteome from self-renewing NSPCs expanded in an endothelial co-culture with differentiating neural culture, we identify a list of membrane proteins that are enriched in NSPCs. In detail, the protocol involves: 1) set-up of an NSPC-endothelial co-culture and NSPC differentiating culture; 2) labeling with azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz); and 3) biotin conjugation to modified sialoglycan for imaging after fixation of neural culture or protein extraction from neural culture for mass spectrometry analysis. Then, the NSPC-enriched surface marker candidates are selected by comparative analysis of mass spectrometry data from both the expanded NSPC and differentiated neural cultures. This protocol is highly sensitive for identifying membrane proteins of low abundance in the starting materials, and it can be applied to marker discovery in other systems with appropriate modifications

Presented here is a protocol that combines an in vitro neural-endothelial co-culture system and metabolic incorporation of sialoglycan with bioorthogonal functional groups to expand primary neural stem and progenitor cells and label their surface sialoglycoproteins for imaging or mass-spectrometry analysis of cell surface markers.

Identificazione dei marcatori di superficie cellulare delle cellule staminali primarie e delle cellule progenitrici mediante l'etichettatura metabolica di Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have identified a special population of vascular cells, the periventricular endothelial cells, that play a critical role in the migration and distribution of forebrain GABAergic interneurons during embryonic development. This, coupled with their cell-autonomous functions, alludes to novel roles of periventricular endothelial cells in the pathology of neuropsychiatric disorders like schizophrenia, epilepsy, and autism. Here, we have described three different in vitro assays that collectively evaluate the functions of periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons. Use of these assays, particularly in a human context, will allow us to identify the link between periventricular endothelial cells and brain disorders. These assays are simple, low cost, and reproducible, and can be easily adapted to any adherent cell type.

We present three simple in vitro assays-the long-distance migration assay, the co-culture migration assay, and chemo-attraction assay-that collectively evaluate the functions of human stem cell derived periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons.

Migrazione, chemio-attrazione, e analisi co-cultura per le cellule endoteliali derivate da cellule staminali umane e neuroni GABAergic

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

Dissezione e isolamento della glia murina da più regioni del sistema nervoso centrale

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models for studying blood-brain barrier (BBB) function. This modified protocol provides detailed steps to derive, expand, and cryopreserve BMECs from human iPSCs using a different donor and reagents than those reported in previous protocols. iPSCs are treated with essential 6 medium for 4 days, followed by 2 days of human endothelial serum-free culture medium supplemented with basic fibroblast growth factor, retinoic acid, and B27 supplement. At day 6, cells are sub-cultured onto a collagen/fibronectin matrix for 2 days. Immunocytochemistry is performed at day 8 for BMEC marker analysis using CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1, and SLC2A1. Western blotting is performed to confirm BMEC marker expression, and absence of SOX17, an endodermal marker. Angiogenic potential is demonstrated with a sprouting assay. Trans-endothelial electrical resistance (TEER) is measured using chopstick electrodes and voltohmmeter starting at day 7. Efflux transporter activity for ATP binding cassette subfamily B member 1 and ATP binding cassette subfamily C member 1 is measured using a multi-plate reader at day 8. Successful derivation of BMECs is confirmed by the presence of relevant cell markers, low levels of SOX17, angiogenic potential, transporter activity, and TEER values ~2000 &#937; x cm2. BMECs are expanded until day 10 before passaging onto freshly coated collagen/fibronectin plates or cryopreserved. This protocol demonstrates that iPSC-derived BMECs can be expanded and passaged at least once. However, lower TEER values and poorer localization of BMEC markers was observed after cryopreservation. BMECs can be utilized in co-culture experiments with other cell types (neurons, glia, pericytes), in three-dimensional brain models (organ-chip and hydrogel), for vascularization of brain organoids, and for studying BBB dysfunction in neuropsychiatric disorders.

This protocol details an adapted method to derive, expand, and cryopreserve brain microvascular endothelial cells obtained by differentiating human induced pluripotent stem cells, and to study blood brain barrier properties in an ex vivo model.

Derivazione, espansione, crioconservazione e caratterizzazione di cellule endoteliali microvascolari cerebrali da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. Microglia can adopt a large spectrum of activation phenotypes. Moreover, microglia that endorse pro-inflammatory phenotype is associated with both neurodevelopmental and neurodegenerative disorders. In vitro studies are widely used in research to evaluate potential therapeutic strategies in specific cell types. In this context studying microglial activation and neuroinflammation in vitro using primary microglial cultures is more relevant than microglial cell lines or stem-cell-derived microglia. However, the use of some primary cultures might suffer from a lack of reproducibility. This protocol proposes a reproducible and relevant method of magnetically isolating microglia from neonate pups. Microglial activation using several stimuli after 4 h and 24 h by mRNA expression quantification and a Cy3-bead phagocytic assay is demonstrated here. The current work is expected to provide an easily reproducible technique for isolating physiologically relevant microglia from juvenile developmental stages.

Primary microglia cultures are commonly used to evaluate new anti-inflammatory molecules. The present protocol describes a reproducible and relevant method to magnetically isolate microglia from neonate pups.