Il nostro protocollo consente l'isolamento e la separazione di KRAS correttamente elaborati ad alta resa. La produzione di KRAS autenticamente farnesilato e carbossimetilato consente di eseguire esperimenti che hanno KRAS nella loro membrana proprio come nelle cellule di mammifero. L'elevata resa del protocollo lo distingue dai lavori precedenti.
In genere purifichiamo da tre a cinque milligrammi di proteine per litro di materiale di espressione. Questo ci permette di condurre una varietà di esperimenti di biologia biofisica e strutturale. KRAS è mutato nel 20% dei tumori e nel 90% nei tumori al pancreas.
Quindi avere un protocollo per produrre proteine autenticamente lavorate è abbastanza utile per lo sviluppo di schermi di farmaci in modo da poter studiare la proteina reale come sarebbe sulla membrana delle cellule tumorali. Questo protocollo è anche molto utile per studiare altre proteine che sono farnesilate e completamente lavorate nelle cellule. E come tale, tutto ciò che devi fare è scambiare il KRAS con la proteina di interesse e metterlo nel baculovirus.
I passaggi critici sono quelli intorno alla cromatografia di scambio di cationi. L'uso della colonna corretta e la limitazione del tempo in cui la proteina è in basso tampone di sale sono essenziali per il successo. Comprendere che le precipitazioni non sono un tipo di evento globo di neve aiuta a guidare le nuove al protocollo.
Ciò è rafforzato mostrando la necessità di dividere il carico della colonna di scambio di cationi in più carichi più piccoli. Dopo aver liscicolato le cellule, chiarito il lisato e purificato la proteina bersaglio da IMAC, analizzare le frazioni proteiche utilizzando la pagina SDS e la colorazione Coomassie. Mettere in comune le frazioni di picco e dializzare la piscina durante la notte contro due litri di tampone D a quattro gradi Celsius.
Il giorno successivo, rimuovere il campione dalla dialisi e centrifugarlo a 4.000 volte g per 10 minuti per rimuovere qualsiasi precipitato. Il campione finale dializzato e chiarificato è spesso ancora nebuloso ma può essere applicato alla colonna CEX senza ulteriori elaborazioni. Preparare una colonna di scambio di cationi da 20 millilitri lavarla con tre volumi di colonna di tampone G, quindi con tre volumi di colonna di tampone F.Next, diluire 20 millilitri del campione dializzato a una concentrazione finale di cloruro di sodio di 100 millimolare aggiungendo 20 millilitri del tampone E e applicare il campione alla colonna di scambio.
È fondamentale diluire la piccola quantità del campione invece di tutto in una volta e i campioni diluiti devono essere applicati alla colonna immediatamente dopo la diluizione per limitare la precipitazione della proteina. Continuare a caricare la colonna con campione appena diluito mentre la diluizione precedente si avvicina alla fine del carico. Quindi lavare la colonna fino all'assorbanza di base 280 con buffer F che in genere richiede tre volumi di colonna.
Eludere la proteina dalla colonna con un gradiente di 400 millilitri dal tampone F al 65% tampone G, raccogliendo l'eluente in sei frazioni millilitri. Una volta completata la sfumatura, continuare a lavare la colonna per ulteriori volumi di 1,5 colonne del 65% tampone G.Scegliere le frazioni positive in base sia alla pagina SDS che all'analisi della macchia Blu Coomassie, nonché l'ispezione della traccia UV del cromatogramma. Quindi mettere in comune la proteina e digerirla con la proteasi His6 TEV secondo le indicazioni manoscritte.
Dopo la digestione e la dialisi, caricare la proteina su una colonna IMAC da 20 millilitri equilibrata con tampone A a tre millilitri al minuto. Raccogliere sette frazioni millilitri durante questa cromatografia e lavare la colonna con un totale di tre volumi di colonna del tampone A o fino al raggiungere l'assorbanza di base. Elute la proteina bersaglio con un gradiente di volume di cinque colonne del tampone C dallo 0% al 10% e raccogliere sette frazioni di millilitro.
Quindi identificare le frazioni positive con la pagina SDS. Se analizzato con la pagina SDS, il lysate chiarificato dovrebbe contenere una banda scura che migra a circa 65 kilodalton che corrisponde alla proteina di fusione His6-MBP-tev-KRAS4b. L'FNTAb co-espresso migra a 48 kilodalton.
Il passaggio CEX all'interno della purificazione è fondamentale perché riduce l'estensione della proteolisi e arricchisce la proteina completamente lavorata, ma è la parte più complicata del protocollo. Un risultato tipico di questo passaggio ha un picco prominente tre con kras4b-FMe, ma i profili di eluizione possono essere variabili. L'analisi di massa intatta con ESIMS conferma la massa molecolare precisa delle proteine e quindi la proporzione relativa di farnesilazione o carbossimetilazione.
Mentre i lotti finali tipici contenevano alcuni KRAS4b-FARN rilevabili, questa proporzione era inferiore al 15% in termini di altezza di picco da questa analisi. L'analisi di massa nativa è stata utilizzata per determinare la massa del KRAS4b legato al PIL. Il solvente campione è stato sostituito con acetato di ammonio per garantire una ionizzazione più morbida che consente al complesso nativo di rimanere intatto.
L'interazione di KRAS4b-FMe e liposomi è stata misurata con la risonanza plasmonica superficiale per convalidare la farnesilazione e la carbossimetilazione sono necessarie affinché KRAS4b-FMe si leghi alle membrane. Come previsto, KRAS4b-FMe è legato ai liposomi mentre KRAS4b non è stato processo. Ridurre al minimo il tempo in cui la proteina è esposta a basso sale è il singolo aspetto più critico del protocollo che influisce sulla resa.
La proteina è solo brevemente a questa bassa concentrazione di sale a seguito della diluizione nel tampone E.La proteina può essere utilizzata per una varietà di esperimenti biofisici che usano mimetici di membrana come liposomi o nanodisc per indagare con quali lipidi kras interagisce. Usando questi dati, possiamo iniziare a estrapolare il modo in cui KRAS interagisce con la membrana plasmatica della cellula. Utilizzando KRAS-FMe purificato, i nostri colleghi sono stati in grado di risolvere la struttura cristallina a raggi X di KRAS in complesso con un chaperone specifico per la forma farnesilata e metilata di questa proteina.
