La regolazione spatiotemporale precisa dei geni è controllata da diversi elementi cis-regolatori che interagiscono tra loro. Il nostro protocollo consente di interrogare quantitativamente i contatti di cromatina di loci selezionati come i promotori. Questa tecnica ci permette di identificare e quantificare contemporaneamente le frequenze di interazione tra vari elementi normativi.
Per generare corpi embrionali, iniziare coltivando cellule staminali embrionali di topo al 60% di confluenza. Quindi rimuovere il mezzo di coltura e lavare due volte con due millilitri di PBS sterilizzato. Rimuovere completamente il PBS e aggiungere due millilitri di supporto di distacco cellulare.
Incubare il piatto di coltura a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione per cinque minuti, aggiungere otto millilitri di mezzo di differenziazione EB al piatto. Per dissociare le colonie mESC per ottenere una sospensione a cella singola, pipettare il mezzo su e giù da 15 a 20 volte e trasferire la sospensione in un tubo da 10 millilitri.
Centrifugare le cellule a 300 volte g a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi rimuovere con cura il supernatante. Dopo aver contato le cellule, rimorsi il pellet cellulare con il mezzo di differenziazione EB.
Invertire il coperchio di un piatto di coltura di 15 centimetri. Utilizzando una pipetta multicanale da 200 microliter, depositare gocce da 20 microliter di cellule rimorsi sul coperchio. Invertire attentamente il coperchio e posizionarlo sulla parte inferiore del piatto della coltura.
Incubare il piatto con le gocce appese per tre giorni. Per raccogliere le cellule dopo l'incubazione, lavare delicatamente il coperchio con 10 millilitri di PBS. Trasferire il PBS, che conterrà gli EB, in un tubo di plastica da 50 millilitri.
Dopo aver lasciato riposare il tubo per 30 minuti a temperatura ambiente, rimuovere con cura il supernatante. Gli EB saranno lasciati nella parte inferiore del tubo. Rimorsi delicatamente gli EB in 10 millilitri di mezzo di differenziazione EB fresco.
Trasferire la sospensione in una piastra batteriologica petri di 10 centimetri. Da tre a sei giorni dopo, utilizzare un microscopio invertito per controllare la formazione di EB. Gli OC dovrebbero essere rotondi e omogenei nelle dimensioni.
Raccogli gli EB da due o tre piatti da 10 centimetri in un tubo di plastica da 50 millilitri. Centrifugare gli EB a 300 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente. Rimuovere con cura il supernatante e rimescolare gli EB in 10 millilitri di PBS.
Centrifugare nuovamente gli EB a 300 volte g a temperatura ambiente, questa volta per tre minuti. Rimuovere il supernatante e aggiungere due millilitri di triptina-EDTA al pellet. Incubare il tubo a 37 gradi Celsius per 15 minuti.
Durante l'incubazione, pipettare su e giù ogni tre minuti per ottenere una sospensione a cella singola. Per fermare la reazione della tripsina, aggiungere otto millilitri di mezzo di differenziazione EB. Dopo aver riaspenso le cellule in mezzo EB fresco, aggiungere la paraformaldeide a una concentrazione finale dell'1%Incubare le cellule per 10 minuti a temperatura ambiente in rotazione.
Tempra la formaldeide aggiungendo glicina ad una concentrazione finale di 0,125 molare. Completare il processo di fissazione come descritto nel manoscritto, quindi congelare i pellet cellulari in azoto liquido. Rimescolare delicatamente il pellet cellulare in tampone dilisi ghiacciato appena preparato e posizionare il tubo sul ghiaccio.
Dopo 15 minuti, centrifugare le cellule a 1.000 volte g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il supernatante e lavare il pellet con 500 microlitri di tampone di lisi fredda. Riutilizzare il pellet in un tubo da 1,5 millilitri con 50 microlitri dello 0,5% di SDS in 1x buffer due e posizionare il tubo in un blocco riscaldante a 62 gradi Celsius.
Dopo 10 minuti, rimuovere il tubo dal blocco riscaldante e aggiungere il tampone di digestione. Mescolare bene con la pipettazione, evitando un'eccessiva schiuma e incubare il tubo a 37 gradi Celsius. Per garantire un'efficiente restrizione della digestione enzimatica, in questo protocollo, abbiamo incluso un passo ripetitivo di digestione.
Ecco perché è anche importante riprotetti bene i nuclei nel tampone di digestione. Aggiungere altri 25 microlitri di tampone di digestione, mescolare invertendo e prendere otto microlitri come controllo non digerito. Conservare il campione di controllo non digerito a -20 gradi Celsius.
Successivamente, si aggiungeranno diverse aliquote dell'enzima di restrizione Mbol, incubando a 37 gradi Celsius in rotazione dopo ogni aliquota. Prendi otto microlitri come campione di controllo digerito. Per scollegare entrambi i campioni di controllo, aggiungere 80 microlitri di te buffer in 10 microlitri di proteinasi K.Incubate a 65 gradi Celsius per un'ora.
Per controllare l'efficienza della digestione, eseguire aliquote da 20 microliter su un gel dello 0,6%. Le digestione di successo mostrano frammenti per lo più nell'intervallo da 3,0 a 5,0 coppie di kilobase. Preparare il DNA per la tosatura come descritto nel manoscritto.
Utilizzare un sonicatore per tagliare il DNA a una dimensione da 150 a 700 coppie di basi. Trasferire il DNA tranciato in un normale nuovo tubo di blocco sicuro, raggruppando più sonicazioni dallo stesso campione. Aggiungere perline di purificazione del DNA riscaldate in una quantità pari a 1,8 volte il volume esistente e mescolare riutilizzando.
Dopo cinque minuti di incubazione, raccogliere le perline con un rack magnetico. Tenendo i tubi nel rack magnetico, lavare le perline due volte con un millilitro di 80% di etanolo preparato al momento. Dopo aver asciugato all'aria le perline a temperatura ambiente per due o tre minuti, elutare il DNA rimospensendo le perline in 1x tampone Tris.
Utilizzando il metodo della goccia appesa, una popolazione omogenea di EB è stata ottenuta sei giorni dopo l'induzione della differenziazione del CES. L'elettroforesi del gel è stata eseguita in tutto il protocollo per il controllo della qualità. Una digestione efficiente da parte di Mbol si traduce in frammenti di meno di tre coppie di kilobase.
L'elettroforesi dopo la legazione ha mostrato che la maggior parte dei frammenti erano più grandi di tre coppie di kilobase. Dopo la sonicazione sono previste dimensioni dei frammenti da 400 a 500 coppie di basi. Dopo la defosforilazione e la legatura dell'adattatore single-end, sono stati eseguiti due cicli di PCR per amplificare gli obiettivi di interesse.
Ogni bersaglio è stato amplificato separatamente con due diverse coppie di primer, A e B per il locus Pou5f1 e C e D per il locus T. Ciò ha portato a uno striscio di DNA di circa 400 coppie di basi. In alternativa, la PCR multiplex è stata eseguita per amplificare simultaneamente i bersagli A e C, con conseguente dimensione del frammento simile dopo la purificazione.
In questi profili 4C, le scatole azzurre indicano la posizione degli esaltatori con cambiamenti dinamici durante la differenziazione. Le regioni di cromatina contattano i promotori dei geni Pou5f1 e T durante la differenziazione EB. Pou5f1 è stato deregolamentato durante la differenziazione EB.
Al contrario, T è stato upregolamentato durante la differenziazione EB. Un'efficiente digestione enzimatica di restrizione e quindi la legazione di prossimità del DNA genomico incrociato sono fattori chiave per garantire il successo di questo protocollo. Un'altra cosa è il progetto del primer per interrogare la mappa dei contatti di ogni luogo.
Questa procedura è ideale per interrogare il contatto con la cromatina a loci mirati. Se sono necessari cambiamenti globali, potrebbero essere eseguiti approcci a livello genomico come Hi-C, promoter capture Hi-C o HiChIP.
