Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione da parte del Fondo nazionale svizzero (31003A_135278) per SST. MOP è il beneficiario di una borsa di dottorato di ricerca del Fondo AXA. Ringraziamo Patricia Nigg aiuto per la progettazione di figura 1.

Nota prima dell&#39;inizio: cappa a flusso laminare e Uso appropriato biocontenimento quando si lavora con virus vivo. Qui, descriviamo le condizioni di crescita idonee a ceppo di virus influenzale cultura A / WSN / 33. Molteplicità di infezione (MOI) e di incubazione possono variare a seconda ceppo virale usato. 1. Preparazione di A biotinilato / WSN / 33 Virus <ol><li> Seed Madin-Darby kindey canino (MDCK), le cellule in un pallone T175 cm 2 utilizzando Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% FBS e 1% di penicillina-streptomicina (Pen / Strep). Cellule di coltura a 37 ° C fino a circa il 70% di confluenza viene raggiunto. </li><li> Prima infezione, rimuovere medie e lavare le cellule con tampone fosfato salino (PBS, pH7.0-7.3) aggiungendo un volume sufficiente a coprire il monostrato cellulare. </li><li> Rimuovere PBS e infettare le cellule con A / WSN / 33 con un MOI di 10 -4. Diluire virus in PBS completati con 0,02 mg Mg 2 +, 0,01 mg di Ca 2+ &lt;/ sup&gt;, lo 0,3% di albumina sierica bovina (BSA), e 1% Pen / Strep (infezione-PBS). Utilizzare un inoculo di 4 ml per una fiasca T175 cm 2. </li><li> Incubare le cellule 1 ora a 37 ° C. Rimuovere inoculo per aspirazione e pipette 10 ml di DMEM integrato con 0,3% di BSA, 20 HEPES mM, e 1% Pen / Strep nel pallone. </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C per circa 3 giorni fino effetto citopatico (CPE) è visibile, e quindi raccolto surnatante. CPE può essere riconosciuto come arrotondamento delle cellule seguono distacco e morte delle cellule 14. </li><li> Spin surnatante a 450 xg per 5 minuti per rimuovere i detriti cellulari. Trasferire il surnatante in un nuovo tubo falco e ripetere questo passaggio ancora una volta. Eliminare il pellet. </li><li> Trasferire supernatanti in provette ultracentrifuga e supernatanti sottopavimenti con 5 ml di saccarosio 30% diluiti in tampone NTE (Tris 10 mM [pH 7,4], NaCl 100 mM, EDTA 1 mM). Equilibrio tubi prima ultracentrifugazione e riempire con PBS per raggiungere un volume fine di 30 ml. Spin Supernaabi- a 112.398 xg (corrispondente a 25.000 rpm per rotore SW28) per 90 min in un&#39;ultracentrifuga. </li><li> Rimuovere con attenzione il surnatante pipettando e immergere pellet virus notte a 4 ° C in 250 l di PBS. Pellet Risospendere pipettando su e giù. Misurare il contenuto di proteine ​​del virus purificato dalla Bradford test 15. </li><li> Utilizzare un kit biotinilazione per generare biotinilato A / WSN / 33. Seguire le istruzioni del produttore. </li><li> In breve, aggiungere la giusta quantità di biotina al virus purificato e incubare per 2 ore su ghiaccio. Trasferimento virus di un tubo ultracentrifuga e riempire il tubo con PBS per raggiungere un volume fine di 30 ml. Spin virus a 112.389 xg per 90 min in un&#39;ultracentrifuga. Rimuovere il surnatante pipettando e aggiungere 250 microlitri di PBS. Immergere pellet per tutta la notte a 4 ° C. Aliquotare e conservare il virus biotinilato conservato a -80 ° C in cui sarà stabile per almeno 24 mesi. NOTA: Potrebbe essere utile per determinare il titolo del p biotinilatoriparazione di IAV mediante test placca standard. Tuttavia, va notato che il protocollo successiva solo misurare particelle virali biotinilati. Rimanendo particelle unbiotinylated causa biotinylation incompleta contribuirà al titolo infettivo mediante saggio di placca ma non al segnale misurato nel test allegato / internalizzazione. </li></ol> 2. Determinare la quantità necessaria di Biotinylated Virus NOTA: Prima di eseguire il test di attacco / internalizzazione, è importante determinare la quantità di virus biotinilato necessaria per infettare tutte le cellule di un campione. <ol><li> Cultura e cellule A549 trypsinize secondo le istruzioni del produttore. Contare le cellule utilizzando una camera di cella. Pipette cellule 200.000 A549 in FACS Deepwell tubi. Spin 3 min a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet con 200 microlitri di PBS. Cellule raffreddare in ghiaccio per 10 minuti. </li><li> Preparare 5-fold diluizioni seriali del biotinylated magazzino virus infezione-PBS. </li><li> Tubi Spin contenenti le cellule a 4 ° C per 3 min a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet con 100 microlitri virus contenenti infezioni PBS. Come utilizzare il controllo finto infezione PBS senza virus biotinilato. Incubare le provette in ghiaccio per 1 ora. </li><li> Tubi Spin a 4 ° C per 3 minuti a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 200 l di PBS. Ripetere questo passaggio ancora una volta. </li><li> Per il fissaggio, tubi di spin a 4 ° C per 3 minuti a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 100 ml di 3,7% paraformaldeide (PFA). Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Quindi, ripetere il lavaggio passo descritto in 2.4). </li><li> Per permeabilizzazione, tubi di spin a 4 ° C per 3 minuti a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 100 l di PBS contenente 0,5% Triton X-100. Incubare per 6 minuti a temperatura ambiente. Quindi, ripetere il lavaggio passo descritto in 2.4). </li><li> Tubi Spin a 4 ° C per 3 minuti a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 50 microlitri 2% BSA in PBS diluito contenente STV-Cy3. (Si prega di notare, la concentrazione appropriata di STV-Cy3 deve essere determinato prima di iniziare l&#39;esperimento Inizia con una concentrazione di 1:. 200 e il test diluizioni 2-fold fino a 1:. 2400 Nelle nostre mani, una diluizione di 1: 1.000 dimostrato essere ottimale.) </li><li> Incubare 1 ora al buio a temperatura ambiente. Quindi, ripetere il passaggio di lavaggio descritta in 2.4, ma risospendere il pellet in 200 ml 2% BSA diluito in PBS. </li><li> Analizzare i campioni mediante citometria di flusso 16. Porta sulla popolazione Cy3-positivo. Scegliere la più bassa concentrazione di virus biotinilato da ottenere il numero massimo di celle Cy3-positivi nella popolazione A549. </li></ol> 3. Determinare la quantità necessaria di Streptavidina NOTA: L&#39;efficienza di bloccare il segnale derivato dal virus extracellulare determina il campo di rilevamento del test. Pertanto, è importante abrogare segnale STV-Cy3 il più possibile. The quantità richiesta di STV necessario dipende dalla quantità di biotinilato magazzino virus usato (determinata al punto 2). <ol><li> Seguire i passaggi 2.1-2.4, ma utilizzare concentrazione di virus determinate al punto 2. </li><li> Preparare diluizioni seriali di cinque-fold di STV diluiti in PBS contenente 2% di BSA e lo 0,1% di sodio azide. </li><li> Tubi Spin a 4 ° C per 3 minuti a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 50 microlitri di diluizione STV. Come utilizzare il controllo finto PBS contenente 2% di BSA e lo 0,1% di sodio azide senza STV. Incubare le provette per 30 min in ghiaccio. Quindi, ripetere il passaggio di lavaggio descritta in 2.4. </li><li> Seguire i passaggi 2,5-2,9. Per il saggio internalizzazione, scegliere la più bassa concentrazione di STV conseguente forte blocco del Cy3 segnale (rispetto al campione in cui non era presente ATS). Per questo, può essere utilizzata la percentuale di cellule positive Cy3 o l&#39;intensità di fluorescenza media del segnale Cy3. Idealmente, il segnale Cy3 di campioni STV trattati deve essere il più vicino possibile al segnale da mock-infettatecelle come possibile. </li></ol> 4. Allegato / Internalizzazione Assay NOTA: Assicurarsi di preparare tutti i reagenti prima di iniziare il test. Per i tre gruppi di controllo presentati nella sezione risultati (cellule infettate finto, le cellule pre-trattate neuraminidasi e cellule sodioazide trattati) piccole modifiche al protocollo sono obbligatori. <ol><li> Preparare 16 provette contenenti deepwell ogni 200.000 cellule A549. Accanto al gruppo sperimentale composto da 4 tubi, ci sono 3 condizioni di controllo, ciascuno dei quali occorrono 4 tubi: cellule mock-infettate, neuraminidasi (NA), le cellule -pretreated e le cellule trattate azide di sodio. Ogni gruppo è composto da 4 tubi etichettati come &#39;0 min&#39;, &#39;0 min + STV&#39;, &#39;30 minuti &#39;, &#39;30 minuti + STV&#39;. </li><li> Tubi Spin a 4 ° C per 3 minuti a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 200 l di PBS. </li><li> Tubi Spin a 4 ° C a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 200 microlitri DMEM contenente 0,3% di BSA, 20 mM HEPES e 1% di penicillina-streptomicina (mezzo di incubazione). Incubare per 30 minuti a 37 ° C. NOTA: Per il controllo neuraminidasi: Utilizzo neuraminidasi batterica (es sialidasi da Vibrio colera) ad una concentrazione di 200 mU / ml diluito in mezzo di incubazione per risospendere le cellule. </li><li> Tubi Spin a 4 ° C per 3 minuti a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 200 l di PBS. Ripetere questo passaggio ancora una volta, poi i tubi raffreddare in ghiaccio per 10 minuti. </li><li> Tubi Spin a 4 ° C per 3 minuti a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 100 ml biotinilati virus (utilizzare la concentrazione di virus determinata al punto 2 diluito in infezioni-PBS). Incubare 1 ora su ghiaccio. Quindi, ripetere il passaggio di lavaggio descritta in 2.4. NOTA: Per il controllo mock-infettate: Usa infezione-PBS, senza virus. Per il controllo sodio azide: Usa virus diluito in infezioni PBS integrato con 0,1% di sodio azide. </li><li> Professionistaelaborazione dei campioni dopo l&#39;infezione su ghiaccio: <ol><li> Per i campioni &quot;0 min&quot;, seguire passo 2.5 e conservare i campioni a 4 ° C fino a quando sono stati fissati gli altri campioni. </li><li> Per il &#39;0 min + STV&#39; campioni, tubi di spin a 4 ° C per 3 minuti a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 50 microlitri STV (utilizzare la concentrazione determinata al punto 3) diluito in PBS contenente 2% di BSA e lo 0,1% di sodio azide (per evitare interiorizzazione durante la manipolazione del campione). Incubare 30 min in ghiaccio. Seguire passo 2.4-2.5 e conservare i campioni a 4 ° C. </li><li> Per i campioni &#39;30 min &#39;, tubi di spin a 4 ° C per 3 minuti a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 200 l di PBS contenente 2% di BSA. Incubare 30 minuti a 37 ° C. Seguire passo 2.4-2.5 e conservare i campioni a 4 ° C. NOTA: Per il controllo sodio azide: Utilizzo PBS integrato con il 2% di BSA e 0,1% di sodio azide per 30 min di incubazione a 37 ° C. </li><li> Per il &#39;30 min + campioni STV &#39;girano provette a 4 ° C per 3 min a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 200 l di PBS contenente 2% di BSA. Incubare 30 minuti a 37 ° C. Poi, tubi di spin a 4 ° C per 3 minuti a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 50 microlitri STV (utilizzare la concentrazione determinata al punto 3) diluito in PBS contenente 2% di BSA e lo 0,1% di sodio azide (per evitare interiorizzazione durante la manipolazione del campione). Incubare 30 min in ghiaccio. Seguire passo 2.4-2.5 e conservare i campioni a 4 ° C. NOTA: Per il controllo sodio azide: Utilizzo PBS integrato con il 2% di BSA e 0,1% di sodio azide per 30 min di incubazione a 37 ° C. </li></ol></li><li> Seguire i passaggi 2,6-2,8 e analizzare campioni mediante citometria a flusso. Determinare la percentuale di cellule positive Cy3-in ciascun campione. </li><li> Calcolare la percentuale allegato virus e la quantità relativa di virus interiorizzato. <ol><li> Per calcolare la quantità di virus in allegato, utilizzare la percentuale di Cy3-positive cellule gated o l&#39;intensità di fluorescenza media del segnale Cy3. Per confronto, impostare cellule non trattate al 100% (Figura 4B). NOTA: La percentuale di virus si è descritto dal campione &quot;0 min&quot;. </li><li> Per calcolare la quantità di virus internalizzato, prendere il rapporto tra il &quot;30 min + STV&quot; campione al &quot;30 min&quot; campione (Figura 5B). NOTA: Come menzionato sopra, la percentuale di cellule positive Cy3 gated o l&#39;intensità di fluorescenza media del segnale Cy3 può essere utilizzato. </li></ol></li></ol>

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

Il nostro protocollo descrive un modo semplice per misurare l&#39;attaccamento virus e internalizzazione mediante citometria a flusso. Esso consente l&#39;utilizzo di virus di tipo selvatico marcato che imita più da vicino le infezioni da virus rispetto all&#39;uso di particelle simili a virus (VLP). Mentre il nostro protocollo è stato ottimizzato per misurare attaccamento e internalizzazione di IAV può essere facilmente adattato per altri virus. Inoltre, come la citometria a flusso è utilizzato per la lettura, co-c...

L&#39;ingresso del virus influenzale A (IAV) è un processo in più fasi che inizia con il legame del virus ai recettori presenti sulla membrana plasmatica delle cellule bersaglio 1. Il recettore per IAV è l&#39;acido sialico che è presente su una grande varietà di glicoproteine ​​e glicolipidi. La emoagglutinina (HA) proteina di IAV che è presente nella busta virale si lega all&#39;acido sialico e media così fissaggio delle particelle virali alla membrana plasmatica di cellule bersaglio 2. Il virus entra nelle cellule tramite endocitosi clatrina-mediata, ma anche percorsi di inserimento alternativi, come macropinocitosi, sono stati descritti 3-6. L&#39;interazione tra HA e acido sialico sembra essere sufficiente per mediare sia, attaccamento e innescando internalizzazione delle particelle virali 7. Tuttavia, i recettori di ingresso alternativi sono stati proposti e il loro ruolo nella voce IAV sono attualmente in fase di studio 1,8,9. Curtualmente, gli sforzi sono fatti per identificare i fattori dell&#39;ospite che sono coinvolti nel ciclo di vita virale con l&#39;obiettivo di sviluppare nuove terapie urgenti antivirali 10-12. Virus ingresso sarebbe un passo favorevole per il targeting crescita IAV al fine di bloccare l&#39;infezione virale nel suo punto più presto. Misurare diverse fasi di ingresso IAV sperimentalmente è impegnativo come di solito grandi quantità di virus sono necessari per individuare il virus in arrivo. Inoltre, il campo di rilevamento delle variazioni entrata del virus è lineare solo a causa della mancanza di replicazione virale. Ciò sottolinea la necessità di test ad alta sensibilità. Il saggio qui presentiamo permette il rilevamento di virus attaccato alla superficie cellulare e rilevamento del virus internalizzato in relazione alla quantità totale di virus associato alle cellule. L&#39;utilizzo di virus di tipo selvatico biotinilato permette conveniente misurazione attraverso colorazione con STV-Cy3 e la lettura mediante citometria a flusso. Virus Biotinilato è freddo legato alla cellas per consentire l&#39;attaccamento, ma impediscono l&#39;internalizzazione delle particelle virali. Le cellule possono essere fissate, permeabilizzate e colorate con STV-Cy3 per misurare il virus allegato. Il segnale da virioni extracellulari, allegati può essere abrogata se un passo bloccante viene applicata prima fissazione in cui le cellule vengono incubate con streptavidina-etichettato (STV). In una fase successiva, a seguito dell&#39;adesione di biotinilato IAV, la temperatura è spostato a 37 ° C e l&#39;interiorizzazione di particelle virali è permesso di prendere posto. Particelle interiorizzato sono protetti da legame di STV consentendo in tal modo la discriminazione tra i virus extra- ed intracellulari. Per condizione sperimentale, sono necessari quattro campioni: &#39;0 min&#39;: Il primo esempio, l&#39;etichetta &#39;0 min&#39;, è quello di misurare il virus legato a freddo sulla superficie cellulare. &#39;0 min + STV&#39;: Il secondo campione, etichettato &#39;0 min + STV&#39;, dà l&#39;intensità del segnale di base di questo esperimento. Il virus si è bloccato with STV e il seguente segnale di colorazione con STV-Cy3 dovrebbero essere molto inferiore rispetto al campione &#39;0 min&#39;. &#39;30 Min &#39;: Il terzo campione, &#39;30 minuti&#39; contiene attaccato e internalizzata virus a causa del passaggio di temperatura a 37 ° C per 30 min. &#39;30 Min + STV &#39;: Il quarto campione, la data del 30 min + STV&#39; misura la frazione intracellulare di virus. Il passo di blocco STV viene applicato dopo il periodo di incubazione 30 min. Come risultato, le particelle virali sulla superficie cellulare sono vincolati da STV lasciando solo virus internalizzati disponibile per colorazione con STV-Cy3. La quantità relativa di virus internalizzati può essere calcolato come rapporto del virus internalizzati (misurata nel &#39;30 min + ATS &#39;esempio) divisa per la quantità totale di virus (descritta dal &#39;30 min&#39; esempio). Come controllo si consiglia di includere cellule mock-infettate. Il segnale seguente STV-Cy3 colorazione delle cellule mock-infettate dà lo sfondorisultante dal protocollo di colorazione. Un controllo per il fissaggio IAV è il pre-trattamento delle cellule con neuraminidasi batterica (NA). Unirà NA off acido sialico da glicoproteine ​​cellulari, eliminando in tal modo i recettori di attacco dalla superficie cellulare. Sodio azide (SA) è un inibitore del metabolismo potenti e quindi blocchi endocitosi 13. Cellule trattate con sodio azide dovrebbero essere positivi per il legame virus, ma negativo per l&#39;internalizzazione.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41966-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-169&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>VWR Calbiochem</td>
			<td>126579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>84100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>Biosolve BV</td>
			<td>20092391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td><a href="https://extranet.fisher.co.uk/insight2_ch/getProduct.do?productCode=W9971E">W9971E&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio Rad Protein Bio Assay</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deepwell tubes (1.2 ml microtubes)</td>
			<td>Milian</td>
			<td>82 00 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>&#160;Lucerna chem&#160; Electron microscopy sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Hemotec HmbH</td>
			<td>253070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>93420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STV-Cy3</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>43-4315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STV</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>43-4302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>71290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacterial neuraminidase/sialidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N6514-1UN</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring attachment and internalization of influenza a virus in a549 cells by flow cytometry

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed protocol for measuring relative changes in the amount of viral particles that attach to A549 cells, a human lung epithelial cell line, as well as in the amount of particles that are internalized into the cell. We use biotinylated virus which can be easily detected following staining with Cy3-labeled streptavidin (STV-Cy3). We describe the growth, purification and biotinylation of A/WSN/33, a widely used IAV laboratory strain. Cold-bound biotinylated IAV particles on A549 cells are stained with STV-Cy3 and measured using flow cytometry. To investigate uptake of viral particles, cold-bound virus is allowed to internalize at 37 &#176;C. In order to differentiate between external and internalized viral particles, a blocking step is applied: Free binding spots on the biotin of attached virus on the cell surface are bound by unlabeled streptavidin (STV). Subsequent cell permeabilization and staining with STV-Cy3 then enables detection of internalized viral particles. We present a calculation to determine the relative amount of internalized virus. This assay is suitable to measure effects of drug-treatments or other manipulations on attachment or internalization of IAV.

Un cartone descrive le quattro diverse condizioni sperimentali è mostrato in Figura 1 I risultati di un esperimento rappresentativo sono presentati nelle Figure 2 -. 5. Nel campione &quot;0 min&quot;, virus biotinilato è freddo legato alle cellule, che possono essere visualizzati da STV-Cy3 colorazione bersaglio (figure 1 e 2). Quando viene applicato un passo di blocco (in &quot;0 min + STV&quot; campione), virus sull...

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Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry.

Misurazione Attaccamento e internalizzazione del virus A in cellule A549 mediante citometria di flusso

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.9K Views.  University of Zurich. We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry. 

Video: Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

Misurazione dell&#39;attività Calpain nelle celle fissi e Living in citometria a flusso

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the T cell receptor (TCR) &alpha; and &beta; loci generates a T cell repertoire with vast diversity in antigen specificity, both to self and foreign. Selection of the repertoire during development in the thymus is critical for generating safe and useful T cells. Defects in thymic selection contribute to the development of autoimmune and immunodeficiency disorders1-4. 
T cell progenitors enter the thymus as double negative (DN) thymocytes that do not express CD4 or CD8 co-receptors. Expression of the &alpha;&beta;TCR and both co-receptors occurs at the double positive (DP) stage. Interaction of the &alpha;&beta;TCR with self-peptide-MHC (pMHC) presented by thymic cells determines the fate of the DP thymocyte. High affinity interactions lead to negative selection and elimination of self-reactive thymocytes. Low affinity interactions result in positive selection and development of CD4 or CD8 single positive (SP) T cells capable of recognizing foreign antigens presented by self-MHC5.
Positive selection can be studied in mice with a polyclonal (wildtype) TCR repertoire by observing the generation of mature T cells. However, they are not ideal for the study of negative selection, which involves deletion of small antigen-specific populations. Many model systems have been used to study negative selection but vary in their ability to recapitulate physiological events6. For example, in vitro stimulation of thymocytes lacks the thymic environment that is intimately involved in selection, while administration of exogenous antigen can lead to non-specific deletion of thymocytes7-9. Currently, the best tools for studying in vivo negative selection are mice that express a transgenic TCR specific for endogenous self-antigen. However, many classical TCR transgenic models are characterized by premature expression of the transgenic TCR&alpha; chain at the DN stage, resulting in premature negative selection. Our lab has developed the HYcd4 model, in which the transgenic HY TCR&alpha; is conditionally expressed at the DP stage, allowing negative selection to occur during the DP to SP transition as occurs in wildtype mice10.
Here, we describe a flow cytometry-based protocol to examine thymic positive and negative selection in the HYcd4 mouse model. While negative selection in HYcd4 mice is highly physiological, these methods can also be applied to other TCR transgenic models. We will also present general strategies for analyzing positive selection in a polyclonal repertoire applicable to any genetically manipulated mice.

We present a flow cytometry-based method to examine T cell development in vivo using genetically manipulated mice on a wildtype or T cell receptor transgenic background.

Esame di Selezione timica positivi e negativi per Citometria a Flusso

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Influenza Virus Propagazione in embrionate di pollo Uova

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

In Vitro Smontaggio del virus influenzale A capsids per centrifugazione in gradiente

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone considering direct medical and hospitalization expenses and work absenteeism2. Animal models are crucial in Influenza A virus (IAV) studies to evaluate viral pathogenesis, host-pathogen interactions, immune responses, and the efficacy of current and/or novel vaccine approaches as well as antivirals. Mice are an advantageous small animal model because their immune system is evolutionarily similar to that found in humans, they are available from commercial vendors as genetically identical subjects, there are multiple strains that can be exploited to evaluate the genetic basis of infections, and they are relatively inexpensive and easy to manipulate. To recapitulate IAV infection in humans via the airways, mice are first anesthetized prior to intranasal inoculation with infectious IAVs under proper biosafety containment. After infection, the pathogenesis of IAVs is determined by monitoring daily the morbidity (body weight loss) and mortality (survival) rate. In addition, viral pathogenesis can also be evaluated by assessing virus replication in the upper (nasal mucosa) or lower (lungs) respiratory tract of infected mice. Humoral responses upon IAV infection can be rapidly evaluated by non-invasive bleeding and secondary antibody detection assays aimed at detecting the presence of total or neutralizing antibodies. Here, we describe the common methods used to infect mice intranasally (i.n) with IAV and evaluate pathogenesis, humoral immune responses and protection efficacy.

Influenza A viruses (IAVs) are important human respiratory pathogens. To understand the pathogenicity of IAVs and to perform preclinical testing of novel vaccine approaches, animal models mimicking human physiology are required. Here, we describe techniques to evaluate IAV pathogenesis, humoral responses and vaccine efficacy using a mouse model of infection.

Studi del Virus di riossidazione A in un modello murino di infezione

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

Neutralizzando le risposte dell'anticorpo al virus A(H3N2) in sieri umani di Microneutralization l'Influenza di misurazione analisi utilizzando cellule MDCK-SIAT1

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Isolamento e coltura In Vitro dei macrofagi alveolari murini ed umani

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

Preparazione del midollo osseo intero per l'analisi della citometria di massa delle cellule di lignaggio neutrofilo

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are cleared from the human lung alveoli by being phagocytosed by innate monocytes and/or neutrophils. This protocol offers a fast and reliable measurement of phagocytosis by flow cytometry using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled conidia for co-incubation with human leukocytes and subsequent counterstaining with an anti-FITC antibody to allow discrimination of internalized and cell-adherent conidia. Major advantages of this protocol are its rapidness, the possibility to combine the assay with cytometric analysis of other cell markers of interest, the simultaneous analysis of monocytes and neutrophils from a single sample and its applicability to other cell wall-bearing fungi or bacteria. Determination of percentages of phagocytosing leukocytes provides a means to microbiologists for evaluating virulence of a pathogen or for comparing pathogen wildtypes and mutants as well as to immunologists for investigating human leukocyte capabilities to combat pathogens.

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

This protocol provides a fast and reliable method to quantitatively measure phagocytosis of Aspergillus fumigatus conidia by human primary phagocytes using flow cytometry and to discriminate phagocytosis of conidia from mere adhesion to leukocytes.

Misurare la fagocitosi di Aspergillus fumigatus Conidia da parte dei Leucociti Umani utilizzando Flow Cytometry

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice

T Follicular Helper (Tfh) cells are an independent CD4+&#160;T cell subset specialized in providing help for germinal center (GC) development and generation of high-affinity antibodies. In influenza virus infection, robust Tfh and GC B cell responses are induced to facilitate effective virus eradication, which confers a qualified mouse model for Tfh-associated study. In this paper, we described protocols in detection of basic Tfh-associated immune response during influenza virus infection in mice. These protocols include: intranasal inoculation of influenza virus; flow cytometry staining and analysis of polyclonal and antigen-specific Tfh cells, GC B cells and plasma cells; immunofluorescence detection of GCs; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) of influenza virus-specific antibody in serum. These assays basically quantify the differentiation and function of Tfh cells in influenza virus infection, thus providing help for studies in elucidating differentiation mechanism and manipulation strategy.

This paper describes protocols of evaluating Tfh and GC B response in mouse model of influenza virus infection.