Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione da parte del Fondo nazionale svizzero (31003A_135278) per SST. MOP è il beneficiario di una borsa di dottorato di ricerca del Fondo AXA. Ringraziamo Patricia Nigg aiuto per la progettazione di figura 1.

Nota prima dell&#39;inizio: cappa a flusso laminare e Uso appropriato biocontenimento quando si lavora con virus vivo. Qui, descriviamo le condizioni di crescita idonee a ceppo di virus influenzale cultura A / WSN / 33. Molteplicità di infezione (MOI) e di incubazione possono variare a seconda ceppo virale usato. 1. Preparazione di A biotinilato / WSN / 33 Virus <ol><li> Seed Madin-Darby kindey canino (MDCK), le cellule in un pallone T175 cm 2 utilizzando Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% FBS e 1% di penicillina-streptomicina (Pen / Strep). Cellule di coltura a 37 ° C fino a circa il 70% di confluenza viene raggiunto. </li><li> Prima infezione, rimuovere medie e lavare le cellule con tampone fosfato salino (PBS, pH7.0-7.3) aggiungendo un volume sufficiente a coprire il monostrato cellulare. </li><li> Rimuovere PBS e infettare le cellule con A / WSN / 33 con un MOI di 10 -4. Diluire virus in PBS completati con 0,02 mg Mg 2 +, 0,01 mg di Ca 2+ &lt;/ sup&gt;, lo 0,3% di albumina sierica bovina (BSA), e 1% Pen / Strep (infezione-PBS). Utilizzare un inoculo di 4 ml per una fiasca T175 cm 2. </li><li> Incubare le cellule 1 ora a 37 ° C. Rimuovere inoculo per aspirazione e pipette 10 ml di DMEM integrato con 0,3% di BSA, 20 HEPES mM, e 1% Pen / Strep nel pallone. </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C per circa 3 giorni fino effetto citopatico (CPE) è visibile, e quindi raccolto surnatante. CPE può essere riconosciuto come arrotondamento delle cellule seguono distacco e morte delle cellule 14. </li><li> Spin surnatante a 450 xg per 5 minuti per rimuovere i detriti cellulari. Trasferire il surnatante in un nuovo tubo falco e ripetere questo passaggio ancora una volta. Eliminare il pellet. </li><li> Trasferire supernatanti in provette ultracentrifuga e supernatanti sottopavimenti con 5 ml di saccarosio 30% diluiti in tampone NTE (Tris 10 mM [pH 7,4], NaCl 100 mM, EDTA 1 mM). Equilibrio tubi prima ultracentrifugazione e riempire con PBS per raggiungere un volume fine di 30 ml. Spin Supernaabi- a 112.398 xg (corrispondente a 25.000 rpm per rotore SW28) per 90 min in un&#39;ultracentrifuga. </li><li> Rimuovere con attenzione il surnatante pipettando e immergere pellet virus notte a 4 ° C in 250 l di PBS. Pellet Risospendere pipettando su e giù. Misurare il contenuto di proteine ​​del virus purificato dalla Bradford test 15. </li><li> Utilizzare un kit biotinilazione per generare biotinilato A / WSN / 33. Seguire le istruzioni del produttore. </li><li> In breve, aggiungere la giusta quantità di biotina al virus purificato e incubare per 2 ore su ghiaccio. Trasferimento virus di un tubo ultracentrifuga e riempire il tubo con PBS per raggiungere un volume fine di 30 ml. Spin virus a 112.389 xg per 90 min in un&#39;ultracentrifuga. Rimuovere il surnatante pipettando e aggiungere 250 microlitri di PBS. Immergere pellet per tutta la notte a 4 ° C. Aliquotare e conservare il virus biotinilato conservato a -80 ° C in cui sarà stabile per almeno 24 mesi. NOTA: Potrebbe essere utile per determinare il titolo del p biotinilatoriparazione di IAV mediante test placca standard. Tuttavia, va notato che il protocollo successiva solo misurare particelle virali biotinilati. Rimanendo particelle unbiotinylated causa biotinylation incompleta contribuirà al titolo infettivo mediante saggio di placca ma non al segnale misurato nel test allegato / internalizzazione. </li></ol> 2. Determinare la quantità necessaria di Biotinylated Virus NOTA: Prima di eseguire il test di attacco / internalizzazione, è importante determinare la quantità di virus biotinilato necessaria per infettare tutte le cellule di un campione. <ol><li> Cultura e cellule A549 trypsinize secondo le istruzioni del produttore. Contare le cellule utilizzando una camera di cella. Pipette cellule 200.000 A549 in FACS Deepwell tubi. Spin 3 min a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet con 200 microlitri di PBS. Cellule raffreddare in ghiaccio per 10 minuti. </li><li> Preparare 5-fold diluizioni seriali del biotinylated magazzino virus infezione-PBS. </li><li> Tubi Spin contenenti le cellule a 4 ° C per 3 min a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet con 100 microlitri virus contenenti infezioni PBS. Come utilizzare il controllo finto infezione PBS senza virus biotinilato. Incubare le provette in ghiaccio per 1 ora. </li><li> Tubi Spin a 4 ° C per 3 minuti a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 200 l di PBS. Ripetere questo passaggio ancora una volta. </li><li> Per il fissaggio, tubi di spin a 4 ° C per 3 minuti a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 100 ml di 3,7% paraformaldeide (PFA). Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Quindi, ripetere il lavaggio passo descritto in 2.4). </li><li> Per permeabilizzazione, tubi di spin a 4 ° C per 3 minuti a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 100 l di PBS contenente 0,5% Triton X-100. Incubare per 6 minuti a temperatura ambiente. Quindi, ripetere il lavaggio passo descritto in 2.4). </li><li> Tubi Spin a 4 ° C per 3 minuti a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 50 microlitri 2% BSA in PBS diluito contenente STV-Cy3. (Si prega di notare, la concentrazione appropriata di STV-Cy3 deve essere determinato prima di iniziare l&#39;esperimento Inizia con una concentrazione di 1:. 200 e il test diluizioni 2-fold fino a 1:. 2400 Nelle nostre mani, una diluizione di 1: 1.000 dimostrato essere ottimale.) </li><li> Incubare 1 ora al buio a temperatura ambiente. Quindi, ripetere il passaggio di lavaggio descritta in 2.4, ma risospendere il pellet in 200 ml 2% BSA diluito in PBS. </li><li> Analizzare i campioni mediante citometria di flusso 16. Porta sulla popolazione Cy3-positivo. Scegliere la più bassa concentrazione di virus biotinilato da ottenere il numero massimo di celle Cy3-positivi nella popolazione A549. </li></ol> 3. Determinare la quantità necessaria di Streptavidina NOTA: L&#39;efficienza di bloccare il segnale derivato dal virus extracellulare determina il campo di rilevamento del test. Pertanto, è importante abrogare segnale STV-Cy3 il più possibile. The quantità richiesta di STV necessario dipende dalla quantità di biotinilato magazzino virus usato (determinata al punto 2). <ol><li> Seguire i passaggi 2.1-2.4, ma utilizzare concentrazione di virus determinate al punto 2. </li><li> Preparare diluizioni seriali di cinque-fold di STV diluiti in PBS contenente 2% di BSA e lo 0,1% di sodio azide. </li><li> Tubi Spin a 4 ° C per 3 minuti a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 50 microlitri di diluizione STV. Come utilizzare il controllo finto PBS contenente 2% di BSA e lo 0,1% di sodio azide senza STV. Incubare le provette per 30 min in ghiaccio. Quindi, ripetere il passaggio di lavaggio descritta in 2.4. </li><li> Seguire i passaggi 2,5-2,9. Per il saggio internalizzazione, scegliere la più bassa concentrazione di STV conseguente forte blocco del Cy3 segnale (rispetto al campione in cui non era presente ATS). Per questo, può essere utilizzata la percentuale di cellule positive Cy3 o l&#39;intensità di fluorescenza media del segnale Cy3. Idealmente, il segnale Cy3 di campioni STV trattati deve essere il più vicino possibile al segnale da mock-infettatecelle come possibile. </li></ol> 4. Allegato / Internalizzazione Assay NOTA: Assicurarsi di preparare tutti i reagenti prima di iniziare il test. Per i tre gruppi di controllo presentati nella sezione risultati (cellule infettate finto, le cellule pre-trattate neuraminidasi e cellule sodioazide trattati) piccole modifiche al protocollo sono obbligatori. <ol><li> Preparare 16 provette contenenti deepwell ogni 200.000 cellule A549. Accanto al gruppo sperimentale composto da 4 tubi, ci sono 3 condizioni di controllo, ciascuno dei quali occorrono 4 tubi: cellule mock-infettate, neuraminidasi (NA), le cellule -pretreated e le cellule trattate azide di sodio. Ogni gruppo è composto da 4 tubi etichettati come &#39;0 min&#39;, &#39;0 min + STV&#39;, &#39;30 minuti &#39;, &#39;30 minuti + STV&#39;. </li><li> Tubi Spin a 4 ° C per 3 minuti a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 200 l di PBS. </li><li> Tubi Spin a 4 ° C a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 200 microlitri DMEM contenente 0,3% di BSA, 20 mM HEPES e 1% di penicillina-streptomicina (mezzo di incubazione). Incubare per 30 minuti a 37 ° C. NOTA: Per il controllo neuraminidasi: Utilizzo neuraminidasi batterica (es sialidasi da Vibrio colera) ad una concentrazione di 200 mU / ml diluito in mezzo di incubazione per risospendere le cellule. </li><li> Tubi Spin a 4 ° C per 3 minuti a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 200 l di PBS. Ripetere questo passaggio ancora una volta, poi i tubi raffreddare in ghiaccio per 10 minuti. </li><li> Tubi Spin a 4 ° C per 3 minuti a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 100 ml biotinilati virus (utilizzare la concentrazione di virus determinata al punto 2 diluito in infezioni-PBS). Incubare 1 ora su ghiaccio. Quindi, ripetere il passaggio di lavaggio descritta in 2.4. NOTA: Per il controllo mock-infettate: Usa infezione-PBS, senza virus. Per il controllo sodio azide: Usa virus diluito in infezioni PBS integrato con 0,1% di sodio azide. </li><li> Professionistaelaborazione dei campioni dopo l&#39;infezione su ghiaccio: <ol><li> Per i campioni &quot;0 min&quot;, seguire passo 2.5 e conservare i campioni a 4 ° C fino a quando sono stati fissati gli altri campioni. </li><li> Per il &#39;0 min + STV&#39; campioni, tubi di spin a 4 ° C per 3 minuti a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 50 microlitri STV (utilizzare la concentrazione determinata al punto 3) diluito in PBS contenente 2% di BSA e lo 0,1% di sodio azide (per evitare interiorizzazione durante la manipolazione del campione). Incubare 30 min in ghiaccio. Seguire passo 2.4-2.5 e conservare i campioni a 4 ° C. </li><li> Per i campioni &#39;30 min &#39;, tubi di spin a 4 ° C per 3 minuti a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 200 l di PBS contenente 2% di BSA. Incubare 30 minuti a 37 ° C. Seguire passo 2.4-2.5 e conservare i campioni a 4 ° C. NOTA: Per il controllo sodio azide: Utilizzo PBS integrato con il 2% di BSA e 0,1% di sodio azide per 30 min di incubazione a 37 ° C. </li><li> Per il &#39;30 min + campioni STV &#39;girano provette a 4 ° C per 3 min a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 200 l di PBS contenente 2% di BSA. Incubare 30 minuti a 37 ° C. Poi, tubi di spin a 4 ° C per 3 minuti a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 50 microlitri STV (utilizzare la concentrazione determinata al punto 3) diluito in PBS contenente 2% di BSA e lo 0,1% di sodio azide (per evitare interiorizzazione durante la manipolazione del campione). Incubare 30 min in ghiaccio. Seguire passo 2.4-2.5 e conservare i campioni a 4 ° C. NOTA: Per il controllo sodio azide: Utilizzo PBS integrato con il 2% di BSA e 0,1% di sodio azide per 30 min di incubazione a 37 ° C. </li></ol></li><li> Seguire i passaggi 2,6-2,8 e analizzare campioni mediante citometria a flusso. Determinare la percentuale di cellule positive Cy3-in ciascun campione. </li><li> Calcolare la percentuale allegato virus e la quantità relativa di virus interiorizzato. <ol><li> Per calcolare la quantità di virus in allegato, utilizzare la percentuale di Cy3-positive cellule gated o l&#39;intensità di fluorescenza media del segnale Cy3. Per confronto, impostare cellule non trattate al 100% (Figura 4B). NOTA: La percentuale di virus si è descritto dal campione &quot;0 min&quot;. </li><li> Per calcolare la quantità di virus internalizzato, prendere il rapporto tra il &quot;30 min + STV&quot; campione al &quot;30 min&quot; campione (Figura 5B). NOTA: Come menzionato sopra, la percentuale di cellule positive Cy3 gated o l&#39;intensità di fluorescenza media del segnale Cy3 può essere utilizzato. </li></ol></li></ol>

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</ol>

The authors have nothing to disclose.

Il nostro protocollo descrive un modo semplice per misurare l&#39;attaccamento virus e internalizzazione mediante citometria a flusso. Esso consente l&#39;utilizzo di virus di tipo selvatico marcato che imita più da vicino le infezioni da virus rispetto all&#39;uso di particelle simili a virus (VLP). Mentre il nostro protocollo è stato ottimizzato per misurare attaccamento e internalizzazione di IAV può essere facilmente adattato per altri virus. Inoltre, come la citometria a flusso è utilizzato per la lettura, co-c...

L&#39;ingresso del virus influenzale A (IAV) è un processo in più fasi che inizia con il legame del virus ai recettori presenti sulla membrana plasmatica delle cellule bersaglio 1. Il recettore per IAV è l&#39;acido sialico che è presente su una grande varietà di glicoproteine ​​e glicolipidi. La emoagglutinina (HA) proteina di IAV che è presente nella busta virale si lega all&#39;acido sialico e media così fissaggio delle particelle virali alla membrana plasmatica di cellule bersaglio 2. Il virus entra nelle cellule tramite endocitosi clatrina-mediata, ma anche percorsi di inserimento alternativi, come macropinocitosi, sono stati descritti 3-6. L&#39;interazione tra HA e acido sialico sembra essere sufficiente per mediare sia, attaccamento e innescando internalizzazione delle particelle virali 7. Tuttavia, i recettori di ingresso alternativi sono stati proposti e il loro ruolo nella voce IAV sono attualmente in fase di studio 1,8,9. Curtualmente, gli sforzi sono fatti per identificare i fattori dell&#39;ospite che sono coinvolti nel ciclo di vita virale con l&#39;obiettivo di sviluppare nuove terapie urgenti antivirali 10-12. Virus ingresso sarebbe un passo favorevole per il targeting crescita IAV al fine di bloccare l&#39;infezione virale nel suo punto più presto. Misurare diverse fasi di ingresso IAV sperimentalmente è impegnativo come di solito grandi quantità di virus sono necessari per individuare il virus in arrivo. Inoltre, il campo di rilevamento delle variazioni entrata del virus è lineare solo a causa della mancanza di replicazione virale. Ciò sottolinea la necessità di test ad alta sensibilità. Il saggio qui presentiamo permette il rilevamento di virus attaccato alla superficie cellulare e rilevamento del virus internalizzato in relazione alla quantità totale di virus associato alle cellule. L&#39;utilizzo di virus di tipo selvatico biotinilato permette conveniente misurazione attraverso colorazione con STV-Cy3 e la lettura mediante citometria a flusso. Virus Biotinilato è freddo legato alla cellas per consentire l&#39;attaccamento, ma impediscono l&#39;internalizzazione delle particelle virali. Le cellule possono essere fissate, permeabilizzate e colorate con STV-Cy3 per misurare il virus allegato. Il segnale da virioni extracellulari, allegati può essere abrogata se un passo bloccante viene applicata prima fissazione in cui le cellule vengono incubate con streptavidina-etichettato (STV). In una fase successiva, a seguito dell&#39;adesione di biotinilato IAV, la temperatura è spostato a 37 ° C e l&#39;interiorizzazione di particelle virali è permesso di prendere posto. Particelle interiorizzato sono protetti da legame di STV consentendo in tal modo la discriminazione tra i virus extra- ed intracellulari. Per condizione sperimentale, sono necessari quattro campioni: &#39;0 min&#39;: Il primo esempio, l&#39;etichetta &#39;0 min&#39;, è quello di misurare il virus legato a freddo sulla superficie cellulare. &#39;0 min + STV&#39;: Il secondo campione, etichettato &#39;0 min + STV&#39;, dà l&#39;intensità del segnale di base di questo esperimento. Il virus si è bloccato with STV e il seguente segnale di colorazione con STV-Cy3 dovrebbero essere molto inferiore rispetto al campione &#39;0 min&#39;. &#39;30 Min &#39;: Il terzo campione, &#39;30 minuti&#39; contiene attaccato e internalizzata virus a causa del passaggio di temperatura a 37 ° C per 30 min. &#39;30 Min + STV &#39;: Il quarto campione, la data del 30 min + STV&#39; misura la frazione intracellulare di virus. Il passo di blocco STV viene applicato dopo il periodo di incubazione 30 min. Come risultato, le particelle virali sulla superficie cellulare sono vincolati da STV lasciando solo virus internalizzati disponibile per colorazione con STV-Cy3. La quantità relativa di virus internalizzati può essere calcolato come rapporto del virus internalizzati (misurata nel &#39;30 min + ATS &#39;esempio) divisa per la quantità totale di virus (descritta dal &#39;30 min&#39; esempio). Come controllo si consiglia di includere cellule mock-infettate. Il segnale seguente STV-Cy3 colorazione delle cellule mock-infettate dà lo sfondorisultante dal protocollo di colorazione. Un controllo per il fissaggio IAV è il pre-trattamento delle cellule con neuraminidasi batterica (NA). Unirà NA off acido sialico da glicoproteine ​​cellulari, eliminando in tal modo i recettori di attacco dalla superficie cellulare. Sodio azide (SA) è un inibitore del metabolismo potenti e quindi blocchi endocitosi 13. Cellule trattate con sodio azide dovrebbero essere positivi per il legame virus, ma negativo per l&#39;internalizzazione.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>41966-052</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-169&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>VWR Calbiochem</td><td>126579</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630-100</td><td></td></tr><tr><td>D-Sucrose</td><td>Fluka</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Biosolve BV</td><td>20092391</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3680</td><td></td></tr><tr><td>EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN kit</td><td>Fisher Scientific</td><td>&lt;a href=&quot;https://extranet.fisher.co.uk/insight2_ch/getProduct.do?productCode=W9971E&quot;&gt;W9971E&amp;nbsp;&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Bio Rad Protein Bio Assay</td><td>Bio Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>deepwell tubes (1.2 ml microtubes)</td><td>Milian</td><td>82 00 001</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>&amp;nbsp;Lucerna chem&amp;nbsp; Electron microscopy sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>ultracentrifuge tubes</td><td>Hemotec HmbH</td><td>253070</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka</td><td>93420</td><td></td></tr><tr><td>STV-Cy3</td><td>Life Technologies</td><td>43-4315</td><td></td></tr><tr><td>STV</td><td>Life Technologies</td><td>43-4302</td><td></td></tr><tr><td>sodium azide</td><td>Fluka</td><td>71290</td><td></td></tr><tr><td>bacterial neuraminidase/sialidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6514-1UN</td><td></td></tr></tbody></table>

measuring attachment and internalization of influenza a virus in a549 cells by flow cytometry

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed protocol for measuring relative changes in the amount of viral particles that attach to A549 cells, a human lung epithelial cell line, as well as in the amount of particles that are internalized into the cell. We use biotinylated virus which can be easily detected following staining with Cy3-labeled streptavidin (STV-Cy3). We describe the growth, purification and biotinylation of A/WSN/33, a widely used IAV laboratory strain. Cold-bound biotinylated IAV particles on A549 cells are stained with STV-Cy3 and measured using flow cytometry. To investigate uptake of viral particles, cold-bound virus is allowed to internalize at 37 &#176;C. In order to differentiate between external and internalized viral particles, a blocking step is applied: Free binding spots on the biotin of attached virus on the cell surface are bound by unlabeled streptavidin (STV). Subsequent cell permeabilization and staining with STV-Cy3 then enables detection of internalized viral particles. We present a calculation to determine the relative amount of internalized virus. This assay is suitable to measure effects of drug-treatments or other manipulations on attachment or internalization of IAV.

Un cartone descrive le quattro diverse condizioni sperimentali è mostrato in Figura 1 I risultati di un esperimento rappresentativo sono presentati nelle Figure 2 -. 5. Nel campione &quot;0 min&quot;, virus biotinilato è freddo legato alle cellule, che possono essere visualizzati da STV-Cy3 colorazione bersaglio (figure 1 e 2). Quando viene applicato un passo di blocco (in &quot;0 min + STV&quot; campione), virus sull...

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Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry.

Misurazione Attaccamento e internalizzazione del virus A in cellule A549 mediante citometria di flusso

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.1K Views.  University of Zurich. We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry. 

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High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

High-throughput Metodo di rilevazione per il virus dell&#39;influenza

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

Flusso Isolamento citometrica di primari murini di tipo II cellule alveolari epiteliali per gli studi funzionali e molecolari

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion events, making it difficult to quantitatively analyze the sequence of the molecular steps involved. We have developed an in vitro, two-color fluorescence assay to monitor kinetics of single virus particles fusing with a target bilayer on an essentially fluid support.
Influenza viral particles are incubated with a green lipophilic fluorophore to stain the membrane and a red hydrophilic fluorophore to stain the viral interior. We deposit a ganglioside-containing lipid bilayer on the dextran-functionilized glass surface of a flow cell, incubate the viral particles on the planar bilayer and image the fluorescence of a 100 x 100 &mu;m2 area, containing several hundreds of particles, on a CCD camera. By imaging both the red and green fluorescence, we can simultaneously monitor the behavior of the membrane dye (green) and the aqueous content (red) of the particles.
Upon lowering the pH to a value below the fusion pH, the particles will fuse with the membrane. Hemifusion, the merging of the outer leaflet of the viral membrane with the outer leaflet of the target membrane, will be visible as a sudden change in the green fluorescence of a particle. Upon the subsequent fusion of the two remaining distal leaflets a pore will be formed and the red-emitting fluorophore in the viral particle will be released under the target membrane. This event will give rise to a decrease of the red fluorescence of individual particles. Finally, the integrated fluorescence from a pH-sensitive fluorophore that is embedded in the target membrane reports on the exact time of the pH drop.
From the three fluorescence-time traces, all the important events (pH drop, lipid mixing upon hemifusion, content mixing upon pore formation) can now be extracted in a straightforward manner and for every particle individually. By collecting the elapsed times for the various transitions for many individual particles in histograms, we can determine the lifetimes of the corresponding intermediates. Even hidden intermediates that do not have a direct fluorescent observable can be visualized directly from these histograms.

We present an in vitro, two-color fluorescence assay to visualize the fusion of single virus particles with a fluid target bilayer. By labeling viral particles with fluorophores that differentially stain the viral membrane and its interior, we are able to monitor the kinetics of hemifusion and pore formation.

Metodo per la misurazione di Cinetica fusione virale a livello di singola particella

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Biologia

Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. While virus-cell attachment can be measured through the use of virions labeled with biotin, radioactive isotopes, or fluorescent dyes, these approaches typically require high multiplicities of infection (MOI) to enable detection of bound virus. We describe a quantitative (q)RT-PCR-based assay that measures Junin virus strain Candid 1 attachment via quantitation of virion-packaged viral genomic RNA. This assay has several advantages including its extreme sensitivity and ability to measure attachment over a large dynamic range of MOIs without the need to purify or label input virus. Importantly, this approach can be easily tailored for use with other viruses through the use of virus-specific qRT-PCR reagents. Further, this assay can be modified to permit measurement of particle endocytosis and genome uncoating. In conclusion, we describe a simple, yet robust assay for highly sensitive measurement of arenavirus-cell attachment.

The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.

Saggio altamente sensibile per la misura dell&#39;attaccamento Arenavirus-cell

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Misurare Influenza neuraminidasi Inibizione anticorpo I titoli da Enzyme-linked lectina Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and Fc-regions. Here, we describe how to measure the activation of Fc effector functions by monoclonal antibodies targeting the influenza virus hemagglutinin with the use of a genetically engineered Jurkat cell line expressing an activating type 1 Fc-Fc&#947;R. Using this method, the contribution of specific Fc-Fc&#947;R interactions conferred by immunoglobulins can be determined using an in vitro assay.

We describe a method to measure the activation of Fc-mediated effector functions by antibodies that target the influenza virus hemagglutinin. This assay can also be adapted to assess the ability of monoclonal antibodies or polyclonal sera targeting other viral surface glycoproteins to induce Fc-mediated immunity.

Un metodo per valutare le funzioni effettrici Fc-mediata indotte dagli anticorpi specifici di Hemagglutinin di riossidazione

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are cleared from the human lung alveoli by being phagocytosed by innate monocytes and/or neutrophils. This protocol offers a fast and reliable measurement of phagocytosis by flow cytometry using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled conidia for co-incubation with human leukocytes and subsequent counterstaining with an anti-FITC antibody to allow discrimination of internalized and cell-adherent conidia. Major advantages of this protocol are its rapidness, the possibility to combine the assay with cytometric analysis of other cell markers of interest, the simultaneous analysis of monocytes and neutrophils from a single sample and its applicability to other cell wall-bearing fungi or bacteria. Determination of percentages of phagocytosing leukocytes provides a means to microbiologists for evaluating virulence of a pathogen or for comparing pathogen wildtypes and mutants as well as to immunologists for investigating human leukocyte capabilities to combat pathogens.

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

This protocol provides a fast and reliable method to quantitatively measure phagocytosis of Aspergillus fumigatus conidia by human primary phagocytes using flow cytometry and to discriminate phagocytosis of conidia from mere adhesion to leukocytes.

Misurare la fagocitosi di Aspergillus fumigatus Conidia da parte dei Leucociti Umani utilizzando Flow Cytometry

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are either time-consuming or unable to detect small variations. Presented here is a protocol for the precise quantification of viral titer by analyzing electrical impedance variations of infected cells in real-time. Cellular impedance is measured through gold microelectrode biosensors located under the cells in microplates, in which magnitude depends on the number of cells as well as their size and shape. This protocol allows real-time analysis of cell proliferation, viability, morphology and migration with enhanced sensitivity. Also provided is an example of a practical application by quantifying the decay of influenza A virus (IAV) submitted to various physicochemical parameters affecting viral infectivity over time (i.e., temperature, salinity, and pH). For such applications, the protocol reduces the workload needed while also generating precise quantification data of infectious virus particles. It allows the comparison of inactivation slopes among different IAV, which reflects their capacity to persist in given environment. This protocol is easy to perform, is highly reproducible, and can be applied to any virus producing cytopathic effects in cell culture.

Reported here is a protocol for the quantification of infectious viral particles using real-time monitoring of electrical impedance of infected cells. A practical application of this method is presented by quantifying influenza A virus decay under different physicochemical parameters mimicking environmental conditions.

Monitoraggio della sopravvivenza del virus influenzale al di fuori dell'ospite utilizzando l'analisi cellulare in tempo reale

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are ...

Measuring the Activation of Fc-Mediated Effector Functions by HA Antibodies

Source: Bailey, M. J., et al. <a href="https://app.jove.com/v/56256">A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates an assay measuring the antibody-mediated activation of T cell effector functions. Adding an influenza virus hemagglutinin (HA)-specific monoclonal antibody to transfected mammalian cells expressing HA results in the formation of immune complexes with HA. Upon introducing engineered T cells expressing Fc receptors and a luciferase reporter, the T cells are activated by the antibody-HA complexes, and this activation is detected by adding a luciferase substrate and measuring the produced bioluminescence.

Misurazione dell'attivazione delle funzioni effettrici mediate da FC da parte degli anticorpi HA

1. Expression of Influenza Virus Hemagglutinin via Transfection

	Plate Human Embryonic Kidney (HEK 293T) cells at a density of 2 x 104 cells/well in a ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Antibody-Based Technologies

Characterization and Functional Analysis

Detection of Bacterial Adherence to Host Cells Using Fluorescence Imaging

Source: Yang, J., et al. <a href="https://app.jove.com/v/62764">Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells.</a> J. Vis. Exp. (2021)
This video demonstrates the bacterial adherence assay to evaluate GFP-tagged bacterial adherence to epithelial cell culture to study the dynamics of host-pathogen interactions using fluorescence microscopy-based imaging.

Rilevamento dell'aderenza batterica alle cellule ospiti mediante imaging a fluorescenza

1. Bacterial adherence and host cell staining

	First, wash the seeded A549 cell monolayers three times with warm 1x PBS. For each wash, add 100 &#956;L ...

Misurazione Attaccamento e internalizzazione del virus A in cellule A549 mediante citometria di flusso

Riepilogo

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High-throughput Metodo di rilevazione per il virus dell'influenza