Lo scopo di questo protocollo è quello di identificare un metodo che possa essere utilizzato per identificare nuovi geni coinvolti nella segnalazione del calcio. Per fare questo, usiamo il classico schermo genetico in avanti. La segnalazione del calcio è un importante percorso di risposta alla difesa in diversi sistemi vegetali.
Per identificare i geni coinvolti in questo percorso, abbiamo usato il classico schermo genetico in avanti. In questo metodo, lo SME sarebbe usato come agente alchilante per introdurre mutazioni casuali nei sistemi vegetali. La generazione mutante sviluppata può quindi essere utilizzata per lo screening per un fenotipo di interesse.
Una volta identificato il fenotipo di interesse, il gene causale può essere mappato. In questo studio, usiamo la pianta modello Arabidopsis che ha l'aequorina reporter del calcio nel suo spettro. Pesare 150 mg di semi di equorina per la mutagenesi dello SME e altri semi da 150 mg da utilizzare come controllo.
Trasferire i semi in un tubo Falcon da 50 ml e aggiungere il 2%EMS o acqua autoclavata. Durante l'uso dello SME, fare attenzione perché è cancerogeno. Gli ingranaggi protettivi devono essere indossati durante l'uso dello SME e qualsiasi tipo di fuoriuscita deve essere prevenuta.
Sigillare i tubi Falcon con paraffina e avvolgerlo in alluminio. Ruotare l'estremità del tubo su un'estremità per 18 ore a temperatura ambiente. Lasciare depositare e rimuovere accuratamente la soluzione EMS e scartare in un contenitore di rifiuti contenente un NaOH molare.
Lavare accuratamente i semi mutagenizzati con 40 ml di acqua autoclavata almeno otto volte. Per il lavaggio finale, aggiungere 100 millimolare tiosulfato di sodio e risciacquare per almeno tre volte per rimuovere tracce di EMS. Immergere i semi in 40 ml di acqua autoclavata per un'ora per diffondere l'EMS dai semi e quindi metterli sulla carta Whatman fino a completa asciugatura.
Trasferire i semi a Eppendorf e incubare a quattro gradi Celsius per due o quattro giorni per la stratificazione. Trasferire sia i semi mutagenizzati che i semi trattati con acqua sul terreno e trasferirli in sale di crescita con un periodo fotografico chiaro di 16 ore e buio di otto ore a 22 gradi Celsius e al 70% di umidità relativa. Per determinare se la mutagenesi ha avuto successo, cercare il settore della clorofilla.
Abbiamo utilizzato il metodo di raccolta dei semi a base di pedigree singolo e ad ogni pianta M1 viene assegnato un numero unico. Al momento della maturazione, i semi vengono raccolti da queste singole piante mutanti e conservati come singole linee M1. Viene utilizzato un protocollo di sterilizzazione dei semi ad alta produttività e radice idroponica delle piante, adattato da Ranf et al.
Il primo giorno, posizionare quasi 12-15 semi M2 per M1 una linea in singoli pozzi di una piastra di coltura tissutale da 24 pozzetti e sterilizzare utilizzando ipoclorito di sodio e soluzione di acido cloridrico con un rapporto di tre è a uno. Questo rilascia gas cloro che sterilizza i semi. Lasciare la piastra per la notte per evaporare completamente il gas cloro rimanente.
Dopo la sterilizzazione, aggiungere mezzi MS liquidi a metà resistenza ai singoli pozzi e stratificare i semi per due o quattro giorni a quattro gradi Celsius, quindi spostare i semi in una camera di crescita con un periodo fotografico di luce di 10 ore e buio 14 ore a 22 gradi Celsius, umidità relativa del 70%. Il giorno 14, una volta che le piantine hanno dagli otto ai 12 giorni, posizionare 12 piantine M2 da ogni linea singolarmente in una piastra luminometrica da 96 po '. Dopo il trasferimento delle piantine, aggiungere 150 microlitri di cinque micromolare soluzione di Coelenterazina nei singoli pozzi e conservare al buio a 21 gradi Celsius per otto ore.
La coelenterazina è un gruppo protesico che si lega all'apoaequorina per formare aequorina funzionale. La coelenterazina è sensibile alla luce e viene quindi conservata in bottiglie di colore scuro protette dalla luce. Il giorno dopo, i mutanti dello schermo usano il perossido di idrogeno come stimolo e misurano la successiva elevazione del calcio.
Per la misurazione simultanea di 24 pozzi, viene realizzato un programma cinetico automatizzato out, che include la misurazione dello sfondo per un minuto, seguito da aggiunta e misurazione dello stimolo per 10 minuti, seguito da iniezione di scarica 150 microliter e misurazione per tre o cinque minuti. E qualsiasi scarico per l'aequorina figlia sarebbe incluso nella lettura per quantificare il calcio misurato e come controllo aggiuntivo per l'aequorina funzionale. Le letture fornite dal metodo precedente sono in unità di luce relative.
Per calcolare la concentrazione citosolica di ioni di calcio, viene utilizzata un'equazione di concentrazione precedentemente descritta data da Rental e Knight nel 2004, che è descritta nel protocollo. Le RLU ottenute dal luminometro vengono aggiunte all'equazione per calcolare la concentrazione di ioni di calcio. I valori di ioni di calcio citosolici ottenuti vengono quindi tracciati graficamente contro un controllo di tipo selvaggio per identificare i mutanti putativi di perossido di idrogeno alla risposta al calcio.
Questo è un risultato rappresentativo del protocollo mostrato. Abbiamo mostrato una linea M1 con 12 piantine individuali che sono state misurate per l'elevazione della concentrazione di ioni di calcio. La linea verde nel grafico indica l'aequorina di tipo selvaggio che è stata misurata insieme ai mutanti.
Il rosso è la media di tutte le 12 piantine, e la linea nera è una singola piantina M2 misurata per l'elevazione degli ioni di calcio. Le piantine che mostrano una risposta altamente ridotta all'applicazione di perossido di idrogeno vengono quindi salvate. I mutanti salvati vengono quindi riconfermati nella generazione successiva, seguiti da una mappatura per identificare i geni causali.
Si dovrebbe prestare attenzione quando si utilizza lo SME come mutageno poiché è cancerogeno. Gli ingranaggi protettivi devono essere indossati in ogni momento e qualsiasi fuoriuscita effettuata deve essere trattata con buone pratiche di laboratorio. Inoltre, quando si fa una raccolta di semi a base di pedigree, le singole piante dovrebbero essere raccolte con la massima cura in modo che non vi sia alcuna miscelazione di semi in nessuna fase.
Questo aiuterà a tornare indietro e rintracciare la pianta madre, che è la pianta mutante omozigota. Inoltre, poiché questo metodo non introduce alcuna distorsione o ipotesi precedenti nel metodo di screening, può essere utilizzato per una o più condizioni per identificare un fenotipo di interesse. Inoltre, più geni indipendenti potrebbero anche essere identificati usando lo stesso protocollo.
Il protocollo è facile da usare poiché con il piccolo dosaggio, un numero enorme di piante può essere mutagenizzato. Questo enorme numero di piante mutanti può essere utilizzato per diverse popolazioni e per diverse condizioni e per identificare diversi geni. Una perdita parziale di funzione, una funzione alterata, una completa perdita di funzione, o anche funzione genica costitutiva possono essere identificate attraverso questo metodo.
La mappatura dovrebbe essere un compito semplice dato l'avanzamento delle tecnologie di mappatura negli scenari correnti. Un sistema di mappatura basato su de novo, un plottaggio razziale basato sull'SNP e molti altri possono essere usati per identificare il gene causale che causa il fenotipo di interesse. Data l'applicabilità di questo metodo, può essere utilizzato non solo sugli impianti modello Arabidopsis, ma anche su altre piante modello a condizione che sia possibile stabilire un fenotipo di lettura degli interessi.
