Questo metodo mantiene campioni biologici in un ambiente nativo e riduce l'artefatto indotto dal fascio di elettroni. Il vantaggio principale è che questa tecnica è applicabile a cellule intere. Quindi le cellule non hanno bisogno di essere disidratate, macchiate o sesate prima della microscopia elettronica.
La capacità di immaginare i recettori sulle cellule tumorali nel contesto dell'intera membrana plasmatica intatta è un aspetto importante che può portare a nuovi approcci terapeutici e allo sviluppo di nuovi farmaci anticancro. Dimostrerò il lavoro con cellule, rivestimento di grafene e microscopia, e Sercan Keskin mostrerà come preparare il grafene. Per iniziare, aggiungere 100 microlitri di sospensione cellulare a due pozzali di una piastra da 96 porri contenente microchip rivestiti di PLL e FLP con la membrana in nitruro di silicio rivolta verso l'alto e 50 microlitri di mezzo privo di siero.
Incubare la piastra a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per cinque minuti per consentire alle cellule di attaccarsi al microchip. Controllare la densità delle cellule sul microchip con un microscopio invertito e assicurarsi che le cellule coprano la finestra con spazio sufficiente per appiattirsi e aderire. Per etichettare HER2 nelle celle, posizionare i microchip nei pozzi della prima riga della piastra di etichettatura.
Quindi, lavare i microchip con PBS BSA. Per prevenire il legame non specifico dell'anticorpo mimetico, incubare i microchip con PBS BSA GS per cinque minuti. Quindi con 200 anticorpi nanomolari mimetici per 10 minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.
Per rimuovere il grafene PMMA dal polimero, pipettare alcune goccioline d'acqua sul polimero attorno al grafene PMMA. Quindi, immergerlo in acqua con un angolo da 30 a 45 gradi per rilasciare il grafene PMMA. Per incidere contaminanti a base di rame, prepaire una soluzione di 50 millilitri di 0,42 persolfuro di sodio molare in acqua.
Utilizzare una diapositiva di vetro standard per trasferire il grafene PMMA nella soluzione di persolfuro di sodio con il lato grafene verso il basso. Il grafene PMMA galleggerà nella parte superiore della soluzione. Lascialo lì durante la notte.
Il giorno successivo, trasferire il grafene PMMA dalla soluzione di persolfuro di sodio in acqua pulita. Lascialo galleggiare in acqua per mezz'ora. Ripetere il lavaggio per un totale di tre volte per rimuovere tutti i residui di persolfuro di sodio dal grafene PMMA.
Quindi, trasferire il grafene PMMA su un cristallo di cloruro di sodio. Preparare una soluzione satura di cloruro di sodio in acqua in una piastra di Petri e trasferire il grafene PMMA sopra la soluzione con il lato grafene verso il basso. Tenere il cristallo di cloruro di sodio con una pinzetta e raccogliere il grafene PMMA galleggiante.
Quindi, tenerlo verticalmente per due minuti per far scorrere l'acqua in eccesso. Lasciare asciugare a temperatura ambiente per 30 minuti e cuocerlo in forno a 100 gradi Celsius per 20 minuti. Rimuovere completamente l'acqua.
Preriscaldare l'acetone in una piastra di Petri di vetro a circa 50 gradi Celsius su una piastra calda nella cappa dei fumi. Guarda attentamente la temperatura per evitare il fuoco. Immergere il grafene PMMA sul sale nella piastra di Petri piena di acetone e lasciarlo sciogliere il PMMA per 30 minuti.
Lasciare asciugare accuratamente il grafene sul sale all'aria prima di utilizzarlo per la preparazione del campione. Lavare un microchip preparato ed etichettato in acqua pura per rimuovere eventuali residui di sale dal tampone e posizionarlo sulla carta da filtro. Le cellule dovrebbero essere visibili come macchie scure.
Utilizzare una lama di rasoio per tagliare il grafene multistrato sul cristallo di cloruro di sodio in un pezzo che si adatta alla finestra di nitruro di silicio di un microchip. Rimuovere il grafene dal cristallo di cloruro di sodio immergerlo in un bicchiere d'acqua, inclinando il cristallo con un angolo di 45 gradi rispetto alla superficie. Prendi il grafene con un anello metallico dalla superficie dell'acqua, quindi tocca la superficie superiore del microchip con la superficie dell'anello inferiore, facendo sì che il microchip si attacchi all'anello metallico.
Il grafene può essere visto sopra il microchip. Sotto uno stereomicroscopio, utilizzare carta da filtro per rimuovere l'acqua rimanente dal microchip in modo che il grafene copra tutte le cellule della finestra del nitruro di silicio. Posizionare il microchip su una carta da filtro con una pinzetta.
Il grafene è visibile come un luccichio viola sul microchip. Trasferire il microchip dalla carta a una piastra di Petri compartimento. Pipettare una goccia d'acqua in uno dei compartimenti liberi e chiudere il coperchio per fornire un'atmosfera satura d'acqua.
Quindi, sigillare il piatto del compartimento con pellicola di paraffina e conservarlo in frigo a quattro gradi Celsius. Impostare l'STEM su 200 kilovolt beam energy utilizzando un campione di allineamento per una dimensione della sonda di almeno 0,2 nanometri regolando le lenti del condensatore. Impostare una corrente di sonda di 180 Picoampere e un semiangolo di convergenza del fascio di 13,2 milliradiani inserendo un'apertura.
Impostare l'intervallo semiangolo di apertura del rilevatore STEM ADF su 68-280 milliradians regolando le impostazioni dell'obiettivo del proiettore. Quindi, imposta le dimensioni dell'immagine STEM su 2048 entro il 2048 pixel e il tempo di rigonfiamento dei pixel su sei microsecondi. Caricare il microchip con cellule rivestite di grafene in un porta campione standard per il tem in modo tale che le cellule siano rivolte verso l'alto e carichino il supporto al microscopio elettronico.
Acquisire un'immagine panoramica con ingrandimento 800 X. Quindi, identificare una regione di interesse e un'immagine delle nanoparticelle di punti quantici a 80.000 X con una dimensione in pixel di 1,3 nanometri. Qui vengono mostrate cellule sementi ottimali.
La finestra è coperta, ma c'è spazio sufficiente per consentire loro di appiattirsi e aderire. Quando troppe cellule sono state seminate su un microchip, non c'era spazio sufficiente per l'adesione di tutte le cellule. Dopo 24 ore, più della metà delle cellule non si è appiattita.
Se vengono seminate troppo poche cellule, la finestra del nitruro di silicio finirà con un grande spazio vuoto dopo 24 ore. Qui vengono mostrate immagini DIC e fluorescenza di cellule sementi ottimali, che dimostrano un'etichettatura di successo di HER2. STEM è stato eseguito su celle SKBR3 rivestite di grafene e non rivestite.
Gli inserti nelle immagini di ingrandimento 800 X sono stati immagini a 80.000 X.Le nanoparticelle di punti quantici sono visibili come punti luminosi con ingrandimento 50.000 X. Per studiare l'effetto dell'illuminazione del fascio di elettroni sul campione, le immagini STEM sono state acquisite in una serie di immagini con una dose di elettroni accumulata. Qui sono riportati i risultati rappresentativi per i campioni non rivestiti e rivestiti di grafene.
L'esposizione di campioni non rivestiti ha portato alla comparizione di strutture luminose sulle superfici cellulari, che non si sono verificati con nessuno dei campioni rivestiti di grafene. La variazione media della distanza relativa delle coppie di particelle è rimasta inferiore all'1,3% per i campioni non rivestiti e inferiore allo 0,8% per i campioni rivestiti. Seguendo questa procedura, diversi tipi di proteine di membrana possono essere immagini su intere cellule usando altri metodi di microscopia.
Questa tecnica consente di immagine delle proteine nella membrana plasmatica intatta per ottenere maggiori informazioni sull'organizzazione della membrana plasmatica e sull'interazione tra le proteine.
