Le linee cellulari HCC4017 e HBEC30KT sono stati gentilmente forniti da laboratorio del Dr. John Minna. Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi Cecil H. e Ida verdi al dottor Li Zhang.

ATTENZIONE: Mentre si lavora con la radioattività, prendere le opportune precauzioni per evitare la contaminazione dello sperimentatore e l&#39;ambiente circostante. Smaltire tutti i rifiuti secondo le linee guida di sicurezza dalle radiazioni locali. 1. Preparazione di cellule <ol><li> Alveoli a 3,5 centimetri piastre tale che la confluenza raggiunge 80% -90% il giorno di dosaggio. <ol><li> Si noti che semina confluenza per le cellule dipende dal tipo di cellula e il loro tasso di crescita. Quando trattando le cellule con un reagente per un certo numero di giorni, seme cellule in modo che la confluenza è 80% -90% il giorno della misurazione eme. Se il numero di cellule ottenute da 3,5 centimetri piastre è insufficiente, utilizzare sei centimetri piastre con stessa quantità di ALA radioattivo come nel passaggio successivo. Nota: L&#39;uso di piatti individuali è raccomandato perché è più facile da gestire singoli piatti. </li></ol></li><li> Un giorno prima della misurazione eme, aggiungere 0,1-0,3 uCi [14C] 5-ALA e freddo ALA per raggiungere un c finaleoncentration di 20 micron di totale ALA per ogni piatto cultura in una misura area di lavoro per lavorare con materiali radioattivi e mettere i piatti di nuovo nel incubatrice. Idealmente, incubare con ALA radioattivo per 16 ore. Nota: marcata radioattivamente 5-ALA richiesto può variare da linee cellulari. Un conteggio radioattivo per minuto (cpm) di almeno 100 per ridurne al minimo l&#39;errore associato conteggio. Si consiglia di determinare una quantità minima di [14 C] 5-ALA richiesto per le linee cellulari in studio. Per maggior parte degli esperimenti 0,1-0,3 pCi è sufficiente per ottenere una buona misura. Aggiunta di freddo ALA è facoltativo. </li></ol> 2. Heme Estrazione <ol><li> Porre le capsule di coltura cellulare su ghiaccio e portarli al fit zona per lavoro radioattività. <ol><li> Eseguire l&#39;intero estrazione e processo di evaporazione in una cappa a prova di esplosione. Perché l&#39;etere memorizzato può esplodere, usare l&#39;etere in piccole bottiglie e far evaporare i liquidi rimanenti, non conservare etereuna bottiglia aperta per più di un mese. Non usare acetone in prossimità di fiamme libere e stufe in quanto è altamente infiammabile. Conservare acetone contenenti reagenti in bottiglie di vetro, come si scioglie coltura di tessuti plastica. </li></ol></li><li> Aspirare fuori dal mezzo con una pipetta. Lavare le cellule una volta con 1 ml di PBS 1x freddo. Aspirare off PBS. </li><li> Aggiungere 1 ml di PBS 1x freddo alle piastre e raccogliere le cellule nella parte inferiore della piastra con un poliziotto gomma. Trasferire le cellule raccolte da ogni piatto a un pre-raffreddata 2 provetta etichettata ml. Raccogliere tutte le cellule in 2 ml provette. Nota: utilizzare un poliziotto in gomma nuova per ogni piastra per raschiare le cellule da ogni piatto. Per ogni piatto si richiederebbe quattro 2 ml tubi, una provetta da 1,5 ml e un flaconcino scintillazione. </li><li> Spin a 15.000 g per 1 min a 4 ° C. </li><li> Estrarre PBS utilizzando una pipetta, dare una breve centrifuga e rimuovere i residui di PBS. Risospendere le cellule in 100 l di 1x PBS. Vortex per risospendere le cellule e mantenere in ghiaccio. </li><li> Prendere 10 &amp;# 956; l dal passaggio 5 e trasferirlo in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga e conservare il ghiaccio per misurare la concentrazione di proteine. Nota: tampone di lisi cellulare deve essere aggiunto alle cellule e tenuti in ghiaccio per misurare la concentrazione di proteine ​​tardi. </li><li> Spin rimanenti 90 microlitri dal punto 5 a 5.000 xg per 30 sec a 4 ° C; rimuovere PBS completamente con un puntale 200 l. </li><li> Aggiungere 300 ml di tampone di estrazione eme (vedi Materiali List) ad ogni provetta. Poi vortex per 15 secondi per mescolare e mettere in ghiaccio per 1 min, ripetere 3 volte. <ol><li> Aggiungere tampone di estrazione eme (HEB) e agitare la provetta rapidamente per risospendere il pellet, fare solo uno o due tubi per volta perché il pellet va risospeso in modo rapido, senza essere lasciato in HEB per troppo tempo. Una volta HEB viene aggiunto a tutti i tubi e pellet viene risospeso quindi seguire il vortice 15 sec e 1 min a ciclo ghiaccio come nel passaggio 8. Si noti che pellet non può andare completamente nella HEB se il pellet viene lasciato nel buffer HEB per un più lungotempo e non risospeso rapidamente. </li></ol></li><li> Aggiungere 1,2 ml di etere etilico a ciascuna provetta e agitare per 30 sec. Spin a 15.000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Nota: Etere etilico esaurisce punte per pipette rapidamente. Per controllare questo, pipetta etere etilico su e giù per una o due volte, così facendo aiuta a tenere l&#39;etere etilico nella pipetta. Ripetere questa operazione ogni volta che un nuovo puntale per pipetta viene utilizzato. </li><li> Trasferire top fase (etere) con 1 ml pipetta in una nuova provetta. Aggiungere 0,5 ml di 2 N HCl, agitare per miscelare e girare come al punto 9. Nota: È difficile vedere la separazione tra fasi eteree e HCl. Quindi, aggiungere piccole quantità di Trypan blu in 2 soluzione N HCl da utilizzare durante l&#39;esperimento, abbastanza per dare un colore azzurro pallido. Questo aiuterà a distinguere le due fasi. La fase inferiore sarà blu e la fase eterea superiore sarà incolore. Trasferire la fase eterea incolore superiore in una nuova provetta e scartare il (blu) fase HCl inferiore. </li><li> Ripetere il passaggio 10 duepiù volte per lavare la fase eterea con 2 N HCl. Trasferire solo la fase eterea superiore in una nuova provetta durante ogni ripetizione ed eliminare la fase HCl inferiore. </li><li> Dopo il terzo lavaggio con HCl, trasferire la fase superiore con 1 ml pipetta ad una fiala di scintillazione. Essiccare i campioni facendo evaporare l&#39;etere etilico, mantenendo i campioni nella cappa chimica O / N. </li></ol> 3. Misura della radioattività <ol><li> Il giorno dopo, aggiungere 5 ml di liquido di scintillazione ai campioni essiccati dal punto 2.12. </li><li> Agitare bene per amalgamare. Misurare la radioattività utilizzando un contatore a scintillazione. </li></ol> 4. Calcoli <ol><li> Lisare le cellule dal punto 2.6 utilizzando la stessa quantità di tampone CelLytic M (vedi lista dei siti) e girare a 14000 g per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Prelevare un&#39;aliquota del surnatante e misurare la concentrazione di proteine ​​utilizzando kit assay proteina BCA. Importo totale di proteine ​​in mg (TP) = (90 ml * conc. Di proteine ​​in81; g / ml) / 1,000 Livello di sintesi dell&#39;eme (radioattività / TP) = pmol / mg di proteina. </li></ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Eme svolge un ruolo chiave nella produzione di energia cellulare attraverso la respirazione 26. Metabolismo alterato eme è noto per essere associato con diverse malattie tra cui il cancro 28,41. L&#39;inibizione della sintesi dell&#39;eme è noto per provocare l&#39;arresto del ciclo cellulare e l&#39;apoptosi in cellule HeLa 26,41. E &#39;stato dimostrato che il livello di sintesi ad alta eme è associato con la progressione delle cellule tumorali del polmone 28. Pertanto, s...

Eme, un complesso di ferro ferroso e protoporfirina IX è una molecola centrale per il trasporto e l&#39;utilizzo dell&#39;ossigeno negli organismi viventi praticamente tutto 1-3. La struttura unica di eme consente di funzionare come un vettore di gas biatomici ed elettroni, nonché per eseguire varie altre funzioni 1-5. Ad esempio, eme lega all&#39;ossigeno in emoglobina e mioglobina per il trasferimento e lo stoccaggio di 6,7 ossigeno. Funziona anche come un vettore di elettroni nei citocromi durante la respirazione e agisce come un donatore di elettroni per reazioni redox catalizzate da enzimi del citocromo P450 8,9. Una delle caratteristiche più significative di eme è che, può giocare un ruolo di regolamentazione nei processi cellulari e molecolari, come la trascrizione genica, la sintesi proteica e micro-RNA biogenesi 4. Ad esempio, colpisce la trascrizione di molti geni controllando l&#39;attività di mammiferi trascrizionale repressore Bach1 e rec nucleare mammiferieptor Rev-erbα 10-15. Heme regola l&#39;attivazione di proteine ​​eme attivatore (HAP) 1 che svolge un ruolo importante nella attivazione dei geni coinvolti nella respirazione e controllo danno ossidativo, in risposta a eme o ossigeno 16. Eme disciplina anche la trascrizione del gene nelle cellule neuronali attraverso fattore di crescita nervoso (NGF) di segnalazione 3,17-20. Esso regola anche la sintesi delle proteine ​​nelle cellule di mammifero eritroidi modulando l&#39;attività di eme-regolata eIF2α chinasi (HRI) 21-24. Inoltre, eme riguarda l&#39;attività delle proteine ​​chiave di segnalazione quali tirosina chinasi Jak2 e Src, che sono essenziali per il funzionamento delle cellule e la corretta crescita cellulare 4,20,25. Si è constatato che in HeLa inibizione cellule eme provoca arresto del ciclo cellulare e l&#39;attivazione di marcatori associati alla senescenza e apoptosi 26. Entrambi carenza eme o aumento dei livelli di eme sono associati a gravi effetti sulla salute negli esseri umani 27. Recente una molecolarend studi epidemiologici hanno mostrato un&#39;associazione positiva di elevata assunzione di eme e aumento del rischio di malattie, come il diabete di tipo 2, malattia coronarica e di diversi tipi di cancro, tra cui il cancro del polmone, il cancro del colon-retto e del pancreas 27,28. Utilizzando una coppia di laboratorio cellule polmonari normali e tumorali autori hanno scoperto che le cellule tumorali hanno aumentato i livelli di consumo di ossigeno, sintesi dell&#39;eme e proteine ​​coinvolte nella eme assorbimento e di ossigeno utilizzo 28. È interessante notare che l&#39;inibizione della sintesi dell&#39;eme diminuito il consumo di ossigeno, la proliferazione, la migrazione e la colonia formazione di cellule tumorali 28. Così, la fluttuazione dei livelli di eme endogena svolge un ruolo importante nella regolazione dei processi molecolari e cellulari 3,4,28,29. Nei mammiferi, la biosintesi dell&#39;eme avviene in otto fasi, coinvolgendo enzimi situati nei mitocondri e citosol 4 (figura 1). Heme Biosyntesi inizia nella matrice dei mitocondri con la condensazione di glicina e succinil-CoA per formare acido 5-aminolevulinico (5-ALA), catalizzata da ALA sintasi (ALAS) 4,31. Questo è il fattore limitante nella biosintesi dell&#39;eme nelle cellule nonerythroid. 5-ALA viene poi esportato verso il citoplasma, dove i prossimi quattro fasi si verificano per formare coproporphyrinogen III (CPgenIII), che viene poi reimportato ai mitocondri, dove viene convertito in protoporfirina IX (PPIX). Infine, una molecola di ferro è incorporato alla protoporfirina IX (PPIX) per produrre eme, una reazione catalizzata dalla ferrochelatase (FECH) 2,4. Il livello di biosintesi dipende principalmente dal livello di ALAS enzima che è strettamente controllata da ferro intracellulare ed eme 4. La biosintesi dell&#39;eme può essere influenzata da difetti genetici, disponibilità di alcuni minerali e vitamine (ad esempio, riboflavina, zinco), l&#39;esposizione a sostanze tossiche (ad esempio, alluminio, piombo), Anossia, febbre, e livelli di alcuni steroidi (per esempio, gli estrogeni) 32-35. Il livello di sintesi dell&#39;eme è alterata in diverse condizioni malate. Diminuzione biosintesi dell&#39;eme può causare anemia così come le malattie neurologiche 3,36. In alternativa, aumento biosintesi dell&#39;eme svolge un ruolo importante nella progressione di alcuni tumori 28,37. Heme ha dimostrato di essere critico per la crescita, la differenziazione e la sopravvivenza di mammiferi adiposo, eritroide e cellule neuronali 4,38-41. Ad esempio, la carenza di eme porta a danni neurite in topo primaria neuroni corticali tramite l&#39;inibizione del glutammato NMDA (N-metil-D-aspartato) receptor 17. Inoltre, l&#39;inibizione della sintesi dell&#39;eme causa la morte cellulare programmata nella cervice carcinoma epiteliale umano cellule HeLa 26,41. Pertanto, misurando i livelli di biosintesi in varie cellule in condizioni diverse è importante per lo studio eziologia e progressisu di molte malattie. Qui si descrive un metodo rapido e sensibile per misurare il livello di sintesi intracellulare eme utilizzando [4- 14 C] acido 5-aminolevulic. Questo è un metodo alternativo per altri metodi che utilizzano 55 Fe o 59 Fe. Preferiamo usando 14 C, perché la sua radiazione è molto debole. Al contrario, una protezione forte è richiesto per lavorare con isotopi Fe. Inoltre, questo metodo è progettato per misurare e confrontare sintesi dell&#39;eme in celle diverse in parallelo in modo rapido. Per misurare i livelli assoluti eme, si può usare il metodo precedentemente stabilito che coinvolge l&#39;uso di HPLC 42,43.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>650501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethy ether</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>296082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (Hydrochloric acid)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A481-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Scintillation cocktail&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>882470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid</td>
			<td>Perkin-Elmer life sciences</td>
			<td></td>
			<td>Store @&#160; -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CelLytic M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2978</td>
			<td>Mammalian cell lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Specific reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Component</td>
			<td>Dispense</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Heme extraction buffer- Acetone: HCl:Water (25:1.3:5)</td>
			<td>Acetone</td>
			<td>25ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated HCl</td>
			<td>1.3ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>5ml</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of heme synthesis levels in mammalian cells

Heme serve come gruppo prostetico per un&#39;ampia varietà di proteine ​​note come emoproteine, come l&#39;emoglobina, mioglobina e citocromi. E &#39;coinvolto in vari processi molecolari e cellulari, come la trascrizione genica, la traduzione, la differenziazione cellulare e la proliferazione cellulare. I livelli di biosintesi dell&#39;eme variano nei diversi tessuti e tipi di cellule e è alterata in condizioni di malati come l&#39;anemia, la neuropatia e il cancro. Questa tecnica utilizza [4- 14 C] acido 5-aminolevulinico ([14 C] 5-ALA), uno dei primi precursori della biosintesi dell&#39;eme per misurare i livelli di sintesi dell&#39;eme in cellule di mammifero. Questo test prevede l&#39;incubazione delle cellule con [14 C] 5-ALA seguita da estrazione di eme e misura della radioattività incorporata in eme. Questa procedura è preciso e veloce. Questo metodo misura i livelli relativi di biosintesi dell&#39;eme, piuttosto che il contenuto totale di eme. Per dimostrare l&#39;uso di questo tecnIQUE i livelli di biosintesi sono stati misurati in diverse linee cellulari di mammifero.

Questo metodo è stato utilizzato per confrontare i livelli di sintesi dell&#39;eme nel normale (HBEC30KT) vs. cancro (HCC4017) cellule polmonari. La Figura 2 mostra un più alto livello di sintesi dell&#39;eme nelle cellule tumorali (HCC4017) rispetto alle cellule polmonari normali (HBEC30KT). Il livello di sintesi dell&#39;eme stata anche misurata in cellule normali e tumorali in presenza di cianuro di carbonile mitocondriale disaccoppiatore 3-chlorophenylhydrazone (CCCP). Le cellule sono state tratta...

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Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

La misurazione dei livelli Heme sintesi in cellule di mammifero

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.0K Views.  University of Texas at Dallas. Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.