Le linee cellulari HCC4017 e HBEC30KT sono stati gentilmente forniti da laboratorio del Dr. John Minna. Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi Cecil H. e Ida verdi al dottor Li Zhang.

ATTENZIONE: Mentre si lavora con la radioattività, prendere le opportune precauzioni per evitare la contaminazione dello sperimentatore e l&#39;ambiente circostante. Smaltire tutti i rifiuti secondo le linee guida di sicurezza dalle radiazioni locali. 1. Preparazione di cellule <ol><li> Alveoli a 3,5 centimetri piastre tale che la confluenza raggiunge 80% -90% il giorno di dosaggio. <ol><li> Si noti che semina confluenza per le cellule dipende dal tipo di cellula e il loro tasso di crescita. Quando trattando le cellule con un reagente per un certo numero di giorni, seme cellule in modo che la confluenza è 80% -90% il giorno della misurazione eme. Se il numero di cellule ottenute da 3,5 centimetri piastre è insufficiente, utilizzare sei centimetri piastre con stessa quantità di ALA radioattivo come nel passaggio successivo. Nota: L&#39;uso di piatti individuali è raccomandato perché è più facile da gestire singoli piatti. </li></ol></li><li> Un giorno prima della misurazione eme, aggiungere 0,1-0,3 uCi [14C] 5-ALA e freddo ALA per raggiungere un c finaleoncentration di 20 micron di totale ALA per ogni piatto cultura in una misura area di lavoro per lavorare con materiali radioattivi e mettere i piatti di nuovo nel incubatrice. Idealmente, incubare con ALA radioattivo per 16 ore. Nota: marcata radioattivamente 5-ALA richiesto può variare da linee cellulari. Un conteggio radioattivo per minuto (cpm) di almeno 100 per ridurne al minimo l&#39;errore associato conteggio. Si consiglia di determinare una quantità minima di [14 C] 5-ALA richiesto per le linee cellulari in studio. Per maggior parte degli esperimenti 0,1-0,3 pCi è sufficiente per ottenere una buona misura. Aggiunta di freddo ALA è facoltativo. </li></ol> 2. Heme Estrazione <ol><li> Porre le capsule di coltura cellulare su ghiaccio e portarli al fit zona per lavoro radioattività. <ol><li> Eseguire l&#39;intero estrazione e processo di evaporazione in una cappa a prova di esplosione. Perché l&#39;etere memorizzato può esplodere, usare l&#39;etere in piccole bottiglie e far evaporare i liquidi rimanenti, non conservare etereuna bottiglia aperta per più di un mese. Non usare acetone in prossimità di fiamme libere e stufe in quanto è altamente infiammabile. Conservare acetone contenenti reagenti in bottiglie di vetro, come si scioglie coltura di tessuti plastica. </li></ol></li><li> Aspirare fuori dal mezzo con una pipetta. Lavare le cellule una volta con 1 ml di PBS 1x freddo. Aspirare off PBS. </li><li> Aggiungere 1 ml di PBS 1x freddo alle piastre e raccogliere le cellule nella parte inferiore della piastra con un poliziotto gomma. Trasferire le cellule raccolte da ogni piatto a un pre-raffreddata 2 provetta etichettata ml. Raccogliere tutte le cellule in 2 ml provette. Nota: utilizzare un poliziotto in gomma nuova per ogni piastra per raschiare le cellule da ogni piatto. Per ogni piatto si richiederebbe quattro 2 ml tubi, una provetta da 1,5 ml e un flaconcino scintillazione. </li><li> Spin a 15.000 g per 1 min a 4 ° C. </li><li> Estrarre PBS utilizzando una pipetta, dare una breve centrifuga e rimuovere i residui di PBS. Risospendere le cellule in 100 l di 1x PBS. Vortex per risospendere le cellule e mantenere in ghiaccio. </li><li> Prendere 10 &amp;# 956; l dal passaggio 5 e trasferirlo in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga e conservare il ghiaccio per misurare la concentrazione di proteine. Nota: tampone di lisi cellulare deve essere aggiunto alle cellule e tenuti in ghiaccio per misurare la concentrazione di proteine ​​tardi. </li><li> Spin rimanenti 90 microlitri dal punto 5 a 5.000 xg per 30 sec a 4 ° C; rimuovere PBS completamente con un puntale 200 l. </li><li> Aggiungere 300 ml di tampone di estrazione eme (vedi Materiali List) ad ogni provetta. Poi vortex per 15 secondi per mescolare e mettere in ghiaccio per 1 min, ripetere 3 volte. <ol><li> Aggiungere tampone di estrazione eme (HEB) e agitare la provetta rapidamente per risospendere il pellet, fare solo uno o due tubi per volta perché il pellet va risospeso in modo rapido, senza essere lasciato in HEB per troppo tempo. Una volta HEB viene aggiunto a tutti i tubi e pellet viene risospeso quindi seguire il vortice 15 sec e 1 min a ciclo ghiaccio come nel passaggio 8. Si noti che pellet non può andare completamente nella HEB se il pellet viene lasciato nel buffer HEB per un più lungotempo e non risospeso rapidamente. </li></ol></li><li> Aggiungere 1,2 ml di etere etilico a ciascuna provetta e agitare per 30 sec. Spin a 15.000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Nota: Etere etilico esaurisce punte per pipette rapidamente. Per controllare questo, pipetta etere etilico su e giù per una o due volte, così facendo aiuta a tenere l&#39;etere etilico nella pipetta. Ripetere questa operazione ogni volta che un nuovo puntale per pipetta viene utilizzato. </li><li> Trasferire top fase (etere) con 1 ml pipetta in una nuova provetta. Aggiungere 0,5 ml di 2 N HCl, agitare per miscelare e girare come al punto 9. Nota: È difficile vedere la separazione tra fasi eteree e HCl. Quindi, aggiungere piccole quantità di Trypan blu in 2 soluzione N HCl da utilizzare durante l&#39;esperimento, abbastanza per dare un colore azzurro pallido. Questo aiuterà a distinguere le due fasi. La fase inferiore sarà blu e la fase eterea superiore sarà incolore. Trasferire la fase eterea incolore superiore in una nuova provetta e scartare il (blu) fase HCl inferiore. </li><li> Ripetere il passaggio 10 duepiù volte per lavare la fase eterea con 2 N HCl. Trasferire solo la fase eterea superiore in una nuova provetta durante ogni ripetizione ed eliminare la fase HCl inferiore. </li><li> Dopo il terzo lavaggio con HCl, trasferire la fase superiore con 1 ml pipetta ad una fiala di scintillazione. Essiccare i campioni facendo evaporare l&#39;etere etilico, mantenendo i campioni nella cappa chimica O / N. </li></ol> 3. Misura della radioattività <ol><li> Il giorno dopo, aggiungere 5 ml di liquido di scintillazione ai campioni essiccati dal punto 2.12. </li><li> Agitare bene per amalgamare. Misurare la radioattività utilizzando un contatore a scintillazione. </li></ol> 4. Calcoli <ol><li> Lisare le cellule dal punto 2.6 utilizzando la stessa quantità di tampone CelLytic M (vedi lista dei siti) e girare a 14000 g per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Prelevare un&#39;aliquota del surnatante e misurare la concentrazione di proteine ​​utilizzando kit assay proteina BCA. Importo totale di proteine ​​in mg (TP) = (90 ml * conc. Di proteine ​​in81; g / ml) / 1,000 Livello di sintesi dell&#39;eme (radioattività / TP) = pmol / mg di proteina. </li></ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Eme svolge un ruolo chiave nella produzione di energia cellulare attraverso la respirazione 26. Metabolismo alterato eme è noto per essere associato con diverse malattie tra cui il cancro 28,41. L&#39;inibizione della sintesi dell&#39;eme è noto per provocare l&#39;arresto del ciclo cellulare e l&#39;apoptosi in cellule HeLa 26,41. E &#39;stato dimostrato che il livello di sintesi ad alta eme è associato con la progressione delle cellule tumorali del polmone 28. Pertanto, s...

Eme, un complesso di ferro ferroso e protoporfirina IX è una molecola centrale per il trasporto e l&#39;utilizzo dell&#39;ossigeno negli organismi viventi praticamente tutto 1-3. La struttura unica di eme consente di funzionare come un vettore di gas biatomici ed elettroni, nonché per eseguire varie altre funzioni 1-5. Ad esempio, eme lega all&#39;ossigeno in emoglobina e mioglobina per il trasferimento e lo stoccaggio di 6,7 ossigeno. Funziona anche come un vettore di elettroni nei citocromi durante la respirazione e agisce come un donatore di elettroni per reazioni redox catalizzate da enzimi del citocromo P450 8,9. Una delle caratteristiche più significative di eme è che, può giocare un ruolo di regolamentazione nei processi cellulari e molecolari, come la trascrizione genica, la sintesi proteica e micro-RNA biogenesi 4. Ad esempio, colpisce la trascrizione di molti geni controllando l&#39;attività di mammiferi trascrizionale repressore Bach1 e rec nucleare mammiferieptor Rev-erbα 10-15. Heme regola l&#39;attivazione di proteine ​​eme attivatore (HAP) 1 che svolge un ruolo importante nella attivazione dei geni coinvolti nella respirazione e controllo danno ossidativo, in risposta a eme o ossigeno 16. Eme disciplina anche la trascrizione del gene nelle cellule neuronali attraverso fattore di crescita nervoso (NGF) di segnalazione 3,17-20. Esso regola anche la sintesi delle proteine ​​nelle cellule di mammifero eritroidi modulando l&#39;attività di eme-regolata eIF2α chinasi (HRI) 21-24. Inoltre, eme riguarda l&#39;attività delle proteine ​​chiave di segnalazione quali tirosina chinasi Jak2 e Src, che sono essenziali per il funzionamento delle cellule e la corretta crescita cellulare 4,20,25. Si è constatato che in HeLa inibizione cellule eme provoca arresto del ciclo cellulare e l&#39;attivazione di marcatori associati alla senescenza e apoptosi 26. Entrambi carenza eme o aumento dei livelli di eme sono associati a gravi effetti sulla salute negli esseri umani 27. Recente una molecolarend studi epidemiologici hanno mostrato un&#39;associazione positiva di elevata assunzione di eme e aumento del rischio di malattie, come il diabete di tipo 2, malattia coronarica e di diversi tipi di cancro, tra cui il cancro del polmone, il cancro del colon-retto e del pancreas 27,28. Utilizzando una coppia di laboratorio cellule polmonari normali e tumorali autori hanno scoperto che le cellule tumorali hanno aumentato i livelli di consumo di ossigeno, sintesi dell&#39;eme e proteine ​​coinvolte nella eme assorbimento e di ossigeno utilizzo 28. È interessante notare che l&#39;inibizione della sintesi dell&#39;eme diminuito il consumo di ossigeno, la proliferazione, la migrazione e la colonia formazione di cellule tumorali 28. Così, la fluttuazione dei livelli di eme endogena svolge un ruolo importante nella regolazione dei processi molecolari e cellulari 3,4,28,29. Nei mammiferi, la biosintesi dell&#39;eme avviene in otto fasi, coinvolgendo enzimi situati nei mitocondri e citosol 4 (figura 1). Heme Biosyntesi inizia nella matrice dei mitocondri con la condensazione di glicina e succinil-CoA per formare acido 5-aminolevulinico (5-ALA), catalizzata da ALA sintasi (ALAS) 4,31. Questo è il fattore limitante nella biosintesi dell&#39;eme nelle cellule nonerythroid. 5-ALA viene poi esportato verso il citoplasma, dove i prossimi quattro fasi si verificano per formare coproporphyrinogen III (CPgenIII), che viene poi reimportato ai mitocondri, dove viene convertito in protoporfirina IX (PPIX). Infine, una molecola di ferro è incorporato alla protoporfirina IX (PPIX) per produrre eme, una reazione catalizzata dalla ferrochelatase (FECH) 2,4. Il livello di biosintesi dipende principalmente dal livello di ALAS enzima che è strettamente controllata da ferro intracellulare ed eme 4. La biosintesi dell&#39;eme può essere influenzata da difetti genetici, disponibilità di alcuni minerali e vitamine (ad esempio, riboflavina, zinco), l&#39;esposizione a sostanze tossiche (ad esempio, alluminio, piombo), Anossia, febbre, e livelli di alcuni steroidi (per esempio, gli estrogeni) 32-35. Il livello di sintesi dell&#39;eme è alterata in diverse condizioni malate. Diminuzione biosintesi dell&#39;eme può causare anemia così come le malattie neurologiche 3,36. In alternativa, aumento biosintesi dell&#39;eme svolge un ruolo importante nella progressione di alcuni tumori 28,37. Heme ha dimostrato di essere critico per la crescita, la differenziazione e la sopravvivenza di mammiferi adiposo, eritroide e cellule neuronali 4,38-41. Ad esempio, la carenza di eme porta a danni neurite in topo primaria neuroni corticali tramite l&#39;inibizione del glutammato NMDA (N-metil-D-aspartato) receptor 17. Inoltre, l&#39;inibizione della sintesi dell&#39;eme causa la morte cellulare programmata nella cervice carcinoma epiteliale umano cellule HeLa 26,41. Pertanto, misurando i livelli di biosintesi in varie cellule in condizioni diverse è importante per lo studio eziologia e progressisu di molte malattie. Qui si descrive un metodo rapido e sensibile per misurare il livello di sintesi intracellulare eme utilizzando [4- 14 C] acido 5-aminolevulic. Questo è un metodo alternativo per altri metodi che utilizzano 55 Fe o 59 Fe. Preferiamo usando 14 C, perché la sua radiazione è molto debole. Al contrario, una protezione forte è richiesto per lavorare con isotopi Fe. Inoltre, questo metodo è progettato per misurare e confrontare sintesi dell&#39;eme in celle diverse in parallelo in modo rapido. Per misurare i livelli assoluti eme, si può usare il metodo precedentemente stabilito che coinvolge l&#39;uso di HPLC 42,43.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>650501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethy ether</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>296082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (Hydrochloric acid)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A481-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Scintillation cocktail&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>882470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid</td>
			<td>Perkin-Elmer life sciences</td>
			<td></td>
			<td>Store @&#160; -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CelLytic M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2978</td>
			<td>Mammalian cell lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Specific reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Component</td>
			<td>Dispense</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Heme extraction buffer- Acetone: HCl:Water (25:1.3:5)</td>
			<td>Acetone</td>
			<td>25ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated HCl</td>
			<td>1.3ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>5ml</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of heme synthesis levels in mammalian cells

Heme serve come gruppo prostetico per un&#39;ampia varietà di proteine ​​note come emoproteine, come l&#39;emoglobina, mioglobina e citocromi. E &#39;coinvolto in vari processi molecolari e cellulari, come la trascrizione genica, la traduzione, la differenziazione cellulare e la proliferazione cellulare. I livelli di biosintesi dell&#39;eme variano nei diversi tessuti e tipi di cellule e è alterata in condizioni di malati come l&#39;anemia, la neuropatia e il cancro. Questa tecnica utilizza [4- 14 C] acido 5-aminolevulinico ([14 C] 5-ALA), uno dei primi precursori della biosintesi dell&#39;eme per misurare i livelli di sintesi dell&#39;eme in cellule di mammifero. Questo test prevede l&#39;incubazione delle cellule con [14 C] 5-ALA seguita da estrazione di eme e misura della radioattività incorporata in eme. Questa procedura è preciso e veloce. Questo metodo misura i livelli relativi di biosintesi dell&#39;eme, piuttosto che il contenuto totale di eme. Per dimostrare l&#39;uso di questo tecnIQUE i livelli di biosintesi sono stati misurati in diverse linee cellulari di mammifero.

Questo metodo è stato utilizzato per confrontare i livelli di sintesi dell&#39;eme nel normale (HBEC30KT) vs. cancro (HCC4017) cellule polmonari. La Figura 2 mostra un più alto livello di sintesi dell&#39;eme nelle cellule tumorali (HCC4017) rispetto alle cellule polmonari normali (HBEC30KT). Il livello di sintesi dell&#39;eme stata anche misurata in cellule normali e tumorali in presenza di cianuro di carbonile mitocondriale disaccoppiatore 3-chlorophenylhydrazone (CCCP). Le cellule sono state tratta...

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Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

La misurazione dei livelli Heme sintesi in cellule di mammifero

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.0K Views.  University of Texas at Dallas. Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Video: Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

Trypsinizing e Trapianto cellule di mammifero

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Ricerca

Biologia

Bioluminescence Imaging of Heme Oxygenase-1 Upregulation in the Gua Sha Procedure

Gua Sha is a traditional Chinese folk therapy that employs skin scraping to cause subcutaneous microvascular blood extravasation and bruises. The protocol for bioluminescent optical imaging of HO-1-luciferase transgenic mice reported in this manuscript provides a rapid in vivo assay of the upregulation of the heme oxygenase-1 (HO-1) gene expression in response to the Gua Sha procedure. HO-1 has long been known to provide cytoprotection against oxidative stress. The upregulation of HO-1, assessed by the bioluminescence output, is thought to represent an antioxidative response to circulating hemoglobin products released by Gua Sha. Gua Sha was administered by repeated strokes of a smooth spoon edge over lubricated skin on the back or other targeted body part of the transgenic mouse until petechiae (splinter hemorrhages) or ecchymosis (bruises) indicative of extravasation of blood from subcutaneous capillaries was observed. After Gua Sha, bioluminescence imaging sessions were carried out daily for several days to follow the dynamics of HO-1 expression in multiple internal organs.

Gua Sha, traditional Chinese therapeutic skin scraping, causes subcutaneous microvascular blood extravasation. We report a protocol of bioluminescence imaging of HO-1-luciferase transgenic mice to demonstrate that Gua Sha upregulates heme oxygenase-1 (HO-1) in multiple organs.

Imaging bioluminescenza di eme ossigenasi-1 sovraregolazione alla Procedura di Gua Sha

Gua Sha is a traditional Chinese folk therapy that employs skin scraping to cause subcutaneous microvascular blood extravasation and bruises. The protocol ...

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

In situ Frazionamento subcellulare di cellule di mammifero aderenti e non aderenti

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

Analisi del DNA doppio filamento Break (DSB) di riparazione in cellule di mammifero

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

EsiRNA MISSIONE per lo screening RNAi in cellule di mammifero

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Analisi della cinetica di esportazione mRNA nucleare in cellule di mammifero da Microiniezione

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to knockdown gene expression levels in loss of gene function studies.
There are two main methods for performing RNAi. The first is the use of small interfering RNAs (siRNAs) that are chemically synthesized, and the second utilizes short-hairpin RNAs (shRNAs) encoded within plasmids 1. The latter can be transfected into cells directly or packaged into replication incompetent lentiviral particles. The main advantages of using lentiviral shRNAs is the ease of introduction into a wide variety of cell types, their ability to stably integrate into the genome for long term gene knockdown and selection, and their efficacy in conducting high-throughput loss of function screens. To facilitate this we have created the LentiPlex pooled shRNA library.
The MISSION LentiPlex Human shRNA Pooled Library is a genome-wide lentiviral pool produced using a proprietary process. The library consists of over 75,000 shRNA constructs from the TRC collection targeting 15,000+ human genes 2. Each library is tested for shRNA representation before product release to ensure robust library coverage. The library is provided in a ready-to-use lentiviral format at titers of at least 5 x 108 TU/ml via p24 assay and is pre-divided into ten subpools of approximately 8,000 shRNA constructs each. Amplification and sequencing primers are also provided for downstream target identification.
Previous studies established a synergistic antitumor activity of TRAIL when combined with Paclitaxel in A549 cells, a human lung carcinoma cell line 3, 4. In this study we demonstrate the application of a pooled LentiPlex shRNA library to rapidly conduct a positive selection screen for genes involved in the cytotoxicity of A549 cells when exposed to TRAIL and Paclitaxel. One barrier often encountered with high-throughput screens is the cost and difficulty in deconvolution; we also detail a cost-effective polyclonal approach utilizing traditional sequencing.

Here we use a human LentiPlex pooled library and traditional sequencing methods to identify gene targets promoting cell survival. We demonstrate how to set up and deconvolute a LentiPlex screen and validate the results.

LentiPlex MISSIONE pool di screening Biblioteca shRNA in cellule di mammifero

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Analisi della posizione ciclo cellulare nelle cellule di mammifero

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

Visualizzazione di mRNA reticolo endoplasmatico localizzate in cellule di mammifero

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.