Questo protocollo consente la produzione di arti aploidi mutagenizzati che possono essere utilizzati per lo screening genetico nell'axolotl. Negli aploidi, anche la mutagenesi di basso livello può produrre perdita di fenotipi di funzione all'interno delle cellule. Questa tecnica di innesto può anche essere utilizzata per salvare fenotipi letali embrionali.
Questo metodo può essere utilizzato per studiare la rigenerazione in qualsiasi specie anfibiana suscettibile di fecondazione e innesto in vitro. Prima di utilizzare embrioni aploidi come donatori, si consiglia di praticare e confermare il successo degli innesti tra embrioni diploidi positivi e negativi della GFP. Per la preparazione del donatore di gameti femminili, anestetizza un axolotl femminile RFP bianco o bianco sessualmente maturo per fungere da donatore di gameti.
Dopo aver confermato la mancanza di risposta alla simulazione del dolore, utilizzare una siringa per insulina calibro 30 per iniettare 0,15 millilitri di gonadotropina corionica umana nella muscolatura dorsale all'arto posteriore. Inserire la siringa con un angolo di 45 gradi sulla linea mediana per evitare il contatto con il midollo spinale. Mettere l'animale iniettato nella soluzione fresca del 40%Holtfreter e trasferire l'axolotl in un frigorifero da otto a 12 gradi Celsius per 48 ore.
Quindi riportare la femmina a temperatura ambiente. Mentre la femmina depone le uova, posiziona un maschio completamente anestetizzato in posizione supina su tovaglioli di carta umidi sotto un microscopio sezionante e posiziona la punta di una pipetta P1000 alla base della cloaca con la mano dominante. Posizionare l'altro indice e il pollice da due a tre centimetri rostrali al bacino e spremere delicatamente l'animale mentre si spostano le dita verso le zampe posteriori per sciacquare i campioni di urina spermica raccogliendo ogni campione in un nuovo tubo di microcentrifugo.
Quindi trasferire cinque microlitri da ogni campione in una piastra di Petri per ispezionare la qualità dello sperma utilizzando un microscopio invertito. Dopo il conteggio, diluire lo sperma a una concentrazione di otto volte 10 al quarto cellule per millilitro in MMR sterile 0,1X e trasferire 0,5 microlitri di spermatozoi per uovo in una nuova piastra di Petri. Quindi utilizzare la punta della pipetta per stendere la sospensione a uno strato spesso un millimetro e utilizzare un sollevatore di plastica per posizionare il campione a quattro centimetri dai bulbi di un reticolatore da 254 nanometri per l'irradiazione a otto volte 10 alle cinque microjoule per millimetro al quadrato.
Dopo aver raccolto un campione di sperma sano, posizionare la femmina in posizione supina su una pila di asciugamani di carta umidi e utilizzare un movimento di vampate di calore simile per estrarre le uova non fecondate dall'axolotl femminile. Quindi utilizzare le forcette bagnate per trasferire le uova in una piastra di Petri di 10 centimetri. Entro 15 minuti dalla raccolta, utilizzare una pipetta P10 per erogare lo sperma irradiato sulle uova non fecondate che rivestino ogni uovo con 0,25-0,5 microlitri di sperma inattivato.
Dopo aver permesso alle uova di sedersi a temperatura ambiente per 30 minuti, inondare le uova di 0,1X MMR. Trenta minuti dopo l'idratazione, utilizzare forcep affilate per sconfesare le uova e posizionare le uova a 18 gradi Celsius per la microiniezione entro sette ore. Per generare una chimera aploide-diploide, posizionare un donatore aploide sano con uno o due embrioni ospiti diploidi positivi alla GFP abbinati allo stadio all'interno del trogolo di un piatto operativo pre-refrigerato contenente mezzo chirurgico su uno stadio di raffreddamento di 10 gradi Celsius o inferiore.
Utilizzare due forcelle di punta dritta autoclavate ultra fini per rimuovere l'intero bocciolo dell'arto e gli strati circostanti di ectoderma e tessuto mesoderma e mettere da parte il tessuto ospite. Rimuovere una foschia tissutale di dimensioni equivalenti dal donatore aploide e posizionare la foschia del tessuto donatore aploide sulla regione corrispondente dell'embrione ospite. Fissare il tessuto con un frammento di vetro rettangolare autoclavato da un vetro di copertura del microscopio schiacciato e premere delicatamente il tessuto nel corpo dell'embrione ospite.
Lasciare l'ancora in posizione per 60-75 minuti controllando ogni 20 minuti per confermare che il vetro non è scivolato prima di utilizzare le forcep per staccare il frammento di vetro di copertura. Trasferire gli embrioni innestati in un mezzo chirurgico fresco che consenta loro di guarire da otto a 12 gradi Celsius durante la notte prima di ospitare gli embrioni innestati individualmente in piastre da 12 o 24 pozzi. Il 38,7% degli ovociti si è sviluppato in embrioni aploidi normalmente sviluppati.
Nella fase di innesto, gli embrioni aploidi mostrano una curvatura ridotta lungo l'asse anteriore-posteriore e un recinto incompleto della spina del tuorlo. Inoltre, un microscopio fluorescente può essere utilizzato per confermare che gli embrioni aploidi sono privi di espressione GFP di derivazione paterna. Gli innesti falliti e impuri producono una varietà di fenotipi.
Quando gli innesti sono puliti e normalmente sviluppati, l'espressione della GFP dovrebbe essere limitata principalmente al plesso brachiale, la rete neurale derivata dal midollo spinale ospite. L'espressione GFP punctate è presente anche in singole cellule che sembrano essere neuroni sensoriali nelle cellule ospiti derivate dal sangue che migrano nell'arto in via di sviluppo. Quando si utilizza donatori positivi alla RFP, gli arti di innesto aploide mostrano un'espressione universale di RFP.
Durante lo sviluppo, gli arti aploidi non mutagenizzati sono significativamente più corti degli arti anteriori diploidi opposti negli animali chimerici. Gli arti aploidi non mutagenizzati si rigenerano completamente, sebbene dimostrino un leggero ritardo nel raggiungere lo stadio di crescita digitale rispetto ai diploidi. Ricordarsi di utilizzare una tecnica sterile e rimuovere e sostituire completamente gli strati completi di mesoderma ed ectoderma dall'ospite embrionale al fine di produrre un arto innestato in modo pulito.
Gli arti mutanti possono essere amputati e segnati per i fenotipi di rigenerazione. Gli alleli mutanti possono essere quantificati con il sequenziamento di nuova generazione. In combinazione con la mutagenesi CRISPR-Cas9, la nostra tecnica di innesto ci ha permesso di condurre uno schermo di selezione negativa di geni mirati negli arti aploidi rigeneranti.
