Questo metodo può essere utilizzato per riprodurre gli eventi infiammatori che si verificano nella pancreatite biliare acuta. È possibile studiare i cambiamenti nel tessuto pancreatico nelle sue fasi iniziali, che generalmente non è possibile in clinica. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è veloce e facile da riprodurre per un ricercatore qualificato e offre risultati simili alla pancreatite acuta negli esseri umani.
Il metodo può essere utilizzato per studiare le risposte immunitarie farmacologiche delle molecole di farmaci e altri interventi terapeutici, in quanto consente lo studio delle cellule infiammatorie-medianti nel pancreas e negli organi adiacenti. Quando si tenta questo protocollo, è fondamentale localizzare gli organi e stabilire la regione di cannulazione. Memorizza la posizione degli organi ed esercita prima l'applicazione di iniezione usando una soluzione colorata come il blu di metilene.
Dopo aver controllato la profondità dell'anestesia con un pizzico di punta, pulire l'area addominale di un topo anestetizzato con una soluzione di iodio povidone al 5%. Utilizzando un trimmer, rimuovere i peli tra il torace e l'addome inferiore e pulire un'area chirurgica di circa due centimetri quadrati con il 70% di alcol. Immobilizzare l'animale sulla tavola chirurgica e utilizzare le forbici per tagliare cinque millimetri di pelle orizzontalmente sulla parte superiore dell'addome e un centimetro sotto il processo xifoide.
Ripetere il taglio sul peritoneo per eseguire la laparotomia con un'esposizione minima della cavità. Usando un divaricatore, tirare il fegato verso la testa a circa un centimetro dall'intestino e localizzare la regione del pancreas e del duodeno. Usando la pinza, sollevare il fegato verso la testa dell'animale.
Tirando delicatamente la porzione dell'intestino tenue, fissare le due estremità laterali con una sutura in polipropilene 6-0 per una migliore visione della porzione distale del dotto biliare comune. Utilizzando una clip per micro vasi, occludere temporaneamente il dotto biliare comune prossimale. Esporre l'organo fuori dalla cavità addominale.
Quindi effettuare un'occlusione temporanea del dotto biliare comune distale con un 8-0 sutura. Per accedere al dotto biliare comune, perforare la regione periampullaria, che appare come una parte biancastra della parete dell'intestino tenue. Con un ago da 0,4 millimetri collegato a un tubo di polietilene da 0,54 millimetri, avviare la pompa di infusione per infusione di soluzione taurocolato di sodio al 2,5% a una velocità costante di 10 microlitri per 10 grammi di peso corporeo per tre minuti.
Dopo l'infusione, rimuovere la clip del micro vaso, il temporaneo 8-0 sutura e l'ago per iniezione dal dotto biliare pancreatico. Suturare l'addome con una sutura in polipropilene monofilamento non assorbente 6-0. Il tempo tra la laparotomia e la sutura finale non deve essere superiore a 30 minuti.
Dopo l'intervento chirurgico, ospitare gli animali in scatole di polietilene rivestite con trucioli di legno e acqua e cibo ad libitum. Tenere delicatamente l'animale con la pelle tirata indietro, promuovendo una leggera sporgenza del bulbo oculare, e posizionare l'animale con l'occhio rivolto verso l'alto. Instillare una goccia di unguento per gli occhi contenente anestetico locale nell'occhio dell'animale.
Posizionare l'estremità di un tubo capillare nell'angolo mediale dell'occhio e inserirlo delicatamente sotto il bulbo oculare con un angolo di circa 30-45 gradi. Ruotare il tubo capillare fino all'inizio del flusso sanguigno. Una volta terminata la raccolta, assicurati l'omeostasi tenendo le palpebre chiuse con una leggera compressione.
Successivamente, utilizzando un ago calibro 27, iniettare quattro millilitri di PBS ghiacciato nella cavità peritoneale del topo. Dopo l'iniezione, massaggiare delicatamente il peritoneo per 10 secondi per rimuovere le cellule aderenti. Usando forbici e pinzette, fai un piccolo taglio di 0,5 centimetri sulla pelle interna e sulla muscolatura per esporre la cavità addominale.
Inserire una pipetta a bulbo nel peritoneo e raccogliere più liquido possibile, facendo attenzione a non aspirare il tessuto adiposo. Raccogliere una parte del pancreas dalla regione della testa per un'ulteriore elaborazione. Depositare il fluido raccolto in tubi tenuti sul ghiaccio.
Quindi centrifugare il liquido peritoneale a 250 volte G per cinque minuti e immagazzinare il surnatante per il dosaggio di interleuchina-6. Per ottenere il siero, centrifugare i campioni di sangue raccolti a 700 volte G per 15 minuti e immagazzinare il surnatante per il dosaggio di amilasi e interleuchina-6. L'analisi del tessuto pancreatico 12 ore dopo l'induzione della pancreatite acuta ha mostrato un'intensa infiammazione nell'organo interessato rispetto ai campioni di tessuto del gruppo sham.
Risultati simili sono stati rappresentati dall'esame istologico dopo colorazione dell'ematossilina eosina di campioni di tessuto da sham e APTA. L'analisi del siero del sangue ha presentato un aumento significativo della concentrazione sierica di amilasi e interleuchina-6 delle citochine nel gruppo AP rispetto al gruppo sham. Allo stesso tempo, la concentrazione di interleuchina-6 era significativamente più alta nel liquido della cavità peritoneale nel gruppo AP.
La gravità della pancreatite in questo modello dipende proporzionalmente dalla concentrazione, dal volume e dalla pressione dell'infusione e dal tempo di induzione della pancreatite acuta. Con l'aiuto di questa tecnica, è possibile studiare gli effetti del lavaggio peritoneale continuo sulla pancreatite acuta grave.
