Inducendo in modo efficiente mutazioni puntili utilizzando l'editor di basi citosina mediate da CRISPR, è possibile identificare la funzionalità delle varianti BRCA1, che è importante per la prevenzione e la diagnosi delle malattie. Il vantaggio di questa tecnica è che muta direttamente BRCA1 espressa endogenamente, che supera la limitazione della valutazione funzionale utilizzando BRCA1 espresso esogenamente. L'identificazione della perdita di mutazioni della funzione di BRCA1 può essere utilizzata per prevedere la possibilità di sviluppare tumori associati a mutazioni BRCA1, come tumori al seno, alle ovaie, alla prostata e al pancreas.
Può anche essere utilizzato per trovare potenziali bersagli farmacologici cercando geni essenziali la cui vitalità è ridotta attraverso l'esaurimento funzionale. Per iniziare, ottenere la sequenza del genoma BRCA1 da GenBank presso NCBI e cercare i 20 siti bersaglio della coppia di basi con la sequenza di motivi adiacenti del protospazio, NGGNCCN, intorno alla mutazione di interesse. La mutazione di interesse deve essere localizzata entro quattro o otto nucleotidi nell'estremità PAM-distale delle sequenze bersaglio dell'RNA guida.
Ordina due oligonucleotidi gratuiti per RNA guida. Per gli oligonucleotidi in avanti, aggiungere CACCG al 5'end della sequenza guida e per gli oligonucleotidi inversi, aggiungere AAC al 5'end e C al 3'end. Dopo aver ricevuto gli oligonucleotidi, resopendirli in acqua distillata ad una concentrazione finale di 100 micromolari.
Mescolare i due oligonucleotidi in omaggio a una concentrazione finale di 10 micromolari con tampone di legatura T4 e scaldarli a 95 gradi Celsius per cinque minuti, quindi raffreddarli a temperatura ambiente per la ricottura. Digerire pRG2 utilizzando l'enzima di restrizione Bsa1 per un'ora a 37 gradi Celsius, quindi eseguire il prodotto digerito su un gel di agarosio dell'1% e purificare la banda di dimensioni appropriate. Legare il duplex oligonucleotide ricotto al DNA vettoriale utilizzando la ligasi del DNA acquistata secondo il protocollo del produttore e trasformarli in cellule competenti DH5-alpha.
Aggiungere i trasformatori a una piastra di agar contenente 100 microgrammi per ampicillina millilitro e incubare la piastra durante la notte a 37 gradi Celsius. Purifica il DNA plasmatico da diversi trasformatori e analizza le loro sequenze di RNA guida sequenziando Sanger con primer che si innescano al promotore U6. Seminare cinque volte 10 alla quinta cellule HAP1-BE3 per pozzo in piastre a 24 pozza un giorno prima della trasfezione e culturerle per raggiungere il 70-80% di confluenza per la trasfezione.
Transfect BRCA1 punta RNA guida utilizzando i reagenti di trasfezione acquistati secondo il protocollo del produttore. Utilizzare un microgrammo di RNA guida di targeting BRCA1 per indurre la conversione da CG a TA nei siti target BRCA1, quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius e sottocultura ogni tre o quattro giorni. Raccogliere i pellet cellulari tre, 10 e 24 giorni dopo la trasfezione per analizzare l'efficienza di editing di base.
Estrarre il DNA genomico usando il kit di purificazione genomica del DNA. Progettare i primi primer PCR per amplificare i siti di destinazione BRCA1. Sebbene non vi siano restrizioni sulle dimensioni del primo prodotto PCR, si consiglia una dimensione del prodotto inferiore a un kilobase per amplificare in modo efficiente una regione specifica.
Progettare i secondi primer PCR situati all'interno del primo prodotto PCR, tenendo conto delle dimensioni dell'amplicon in base alla lunghezza di lettura NGS. Per collegare sequenze essenziali per l'analisi NGS, aggiungere sequenze aggiuntive alle 5'estremità dei secondi primer PCR. Amplificare i siti bersaglio BRCA1 sul DNA genomico ottenuto dai tre punti di tempo utilizzando polimerasi ad alta fedeltà.
Per la prima reazione PCR, utilizzare 100 nanogrammi di DNA genomico per l'amplificazione su 15 cicli. Per la seconda reazione PCR, utilizzare un microliter del primo prodotto PCR per l'amplificazione su 20 cicli. Eseguire cinque microlitri del secondo prodotto PCR con gel di agarosio al 2% e confermare le dimensioni.
Quindi allegare le sequenze essenziali per l'analisi NGS amplificando il secondo prodotto PCR utilizzando i primer elencati nel manoscritto testuale. Amplificare ogni campione utilizzando set di primer diversi. Utilizzare un microlitro del secondo prodotto PCR per un massimo di 30 cicli di amplificazione con una polimerasi ad alta fedeltà.
Eseguire cinque microlitri del prodotto PCR su gel di agarosio al 2% per confermare le dimensioni e purificare l'amplicon utilizzando un kit di pulizia PCR commerciale. Mescolare ogni campione in quantità uguali per creare una libreria NGS. Quantificare la libreria NGS usando uno spettrofotometro e diluirla a una concentrazione di un nanomolare usando tampone di resuspensione o Tris-HCl da 10 millimolare a pH 8,5.
Preparare 100 microlitri della libreria diluiti alla concentrazione di carico appropriata. Come controllo combinato PhiX con il campione diluito. Caricare la libreria sulla cartuccia ed eseguire NGS in base al protocollo del produttore.
Ottieni oltre 10.000 letture per amplicon target per un'analisi approfondita dell'efficienza di editing di base. Questo protocollo è stato utilizzato per eseguire una valutazione funzionale delle varianti endogene BRCA1 generate dagli editor di base citosina basati su CRISPR. Cas-9 e RNA guida sono stati trasfetati in linee cellulari HAP1 per interrompere BRCA1, e le frequenze di mutazione sono state analizzate.
Le frequenze di mutazione sono diminuite significativamente nel tempo nelle linee cellulari HAP1, indicando che BRCA1 è un gene essenziale per la vitalità cellulare in queste cellule. Per indagare se le varianti sostituite da CG a TA influenzano la funzione di BRCA1, i plasmidi del DNA e gli RRNA guida di codifica che potrebbero indurre ogni mutazione sono stati transfettati per avere linee cellulari HAP1-BE3. E le frequenze di sostituzione sono state analizzate.
Le frequenze di sostituzione relative da 3598C a T, una variante patogena che induce una mutazione senza senso, sono drasticamente diminuite. Mentre quelli da 4527C a T, una variante benigna che induce una mutazione senza senso, sono rimasti simili con il tempo. Si è scoperto che le frequenze di sostituzione nucleotidica di queste tre varianti diminuivano in modo dipendente dal tempo.
Poiché è necessario ottenere un'alta frequenza di mutazione iniziale per riconoscere chiaramente il cambiamento nella vitalità cellulare con il superamento della data, è prioritario stabilire condizioni di trasfezione ottimizzate. Questa procedura può essere applicata per verificare altre varianti genetiche sconosciute come BRCA VUS. Può fornire indizi sulla patogenicità delle varianti sconosciute derivate dal paziente e sul loro trattamento.
