La variante di piccola colonia o tecnica SCV consente la selezione e la crescita di piccole varianti di colonia di Pseudomonas aeruginosa. Il metodo è molto definitivo e consente una selezione più semplice rispetto ai metodi normali. Questo protocollo descrive inoltre un metodo ELISA più sicuro e sensibile per la quantificazione degli alginati rispetto al metodo standard del carbazolo dell'acido uronico, consentendo la quantificazione diretta dell'alginato nei campioni senza cautery o manipolazione del campione.
A dimostrare la procedura saranno Brandon Kirby, un tecnico di laboratorio, e Roy Al Ahmar, uno studente laureato del mio laboratorio. Per rilevare la variante di piccola colonia o SCV, prima striscia il ceppo P.aeruginosa PAO1 delta PYRD su piastre PIA prerifodate. Far crescere i ceppi a 37 gradi Celsius per 48 ore.
Sulla piastra di crescita, identificare una singola colonia isolata che ha il fenotipo SCV caratterizzato da una dimensione della colonia da uno a tre millimetri rispetto alla normale dimensione della colonia da tre a cinque millimetri. Ristriature le colonie selezionate per ottenere un isolato puro della SCV. Per eseguire l'attivazione fisiologica della via di recupero, utilizzare un ciclo di inoculazione sterile per preleviare la colonia SCV dalla piastra PIA.
Striare la colonia selezionata su una piastra PIA pre-riscaldata integrata con 0,1 millimolare di uracile. Far crescere il piatto a 37 gradi Celsius per 24-48 ore. Per iniziare il saggio di carbazolo dell'acido uronico, identificare una singola colonia da una coltura pura del ceppo desiderato da testare e raccogliere la colonia usando uno stuzzicadenti sterile.
Posizionare lo stuzzicadenti in una provetta di coltura contenente cinque millilitri di PIB. Crescere in un incubatore shaker a 37 gradi Celsius per 24 ore. Dopo l'incubazione, aggiungere un'aliquota del brodo PIB coltivato su una piastra PIA preri warmed.
Utilizzando uno spargitore di cellule sterile, stendere il brodo sul piatto e crescere a 37 gradi Celsius per 24 ore. Utilizzando un controller di pipetta e una pipetta sterile da 50 millilitri, aggiungere lo 0,85% di cloruro di sodio al prato adulto e raccogliere il campione raschiando la piastra utilizzando uno spargitore di cellule. Aspirare il campione utilizzando una pipetta fresca da 50 millilitri e trasferirlo in un tubo di raccolta da 50 millilitri.
Vortice il campione in alto per mescolare e posizionare i campioni sul ghiaccio. Per misurare l'OD600 dei campioni, prima spegnete lo spettrofotometro utilizzando un millilitro di cloruro di sodio allo 0,85%. Quindi aggiungere un millilitro del campione a una nuova cuvetta usa e getta e leggere l'OD. Ripetere questo passaggio due volte per ottenere un triplice di letture per ogni campione.
Ora aggiungi tre millilitri della soluzione di borato di acido solforico in tubi di coltura e lascia riposare sul ghiaccio. Aggiungere lentamente 350 microlitri del campione raccolto alla miscela acida nelle provette. Dopo aver brevemente vortice basso, aggiungere 100 microlitri di soluzione allo 0,1% di carbazolo ed etanolo alla miscela di campioni acidi.
Fissare il tubo e il vortice sull'impostazione media per cinque secondi. Quindi mettere in un bagno asciutto a 55 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo l'incubazione, vortice i tubi brevemente in alto e lasciare raffreddare per cinque minuti.
Utilizzare il tubo con cloruro di sodio allo 0,85% come vuoto per lo spettrofotometro. Quindi aggiungere un millilitro della miscela a una cuvetta pulita e leggere l'OD dei campioni a 530 nanometri su uno spettrofotometro. Preparare una curva standard misurando l'OD530 delle diluizioni seriali di concentrazioni note di acido d-mannuronico.
Ripetere due volte ed estrarre un'equazione lineare da queste letture. Calcolare la concentrazione dell'alginato in ogni campione usando la curva standard e dividere la concentrazione di alginato dall'equazione lineare per OD600 per ottenere la quantità totale di alginato per OD600. Utilizzando una micropipetta, aggiungere 50 microlitri del campione raccolto a una piastra non trattata da 96 potte.
Quindi aggiungere 50 microlitri di tampone di rivestimento ELISA ai pozzi. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per due ore. Utilizzando un flacone di schizzi, lavare i poggiale due volte con PBS-T riempiendo i pozzi e quindi drenandoli capovolgendo la piastra.
Aggiungere 200 microlitri di tampone di blocco ai pozzi con una micropipetta e incubare a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, lavare il piatto due volte con PBS-T come prima. Quindi aggiungere 100 microlitri di anticorpo primario diluito ai pozzi e incubare a 37 gradi Celsius per una o due ore.
Dopo l'incubazione, lavare i pozzi della piastra tre volte con PBS-T come prima. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di anticorpo secondario diluito ai pozzi e incubare a 37 gradi Celsius per una o due ore. Dopo aver lavato di nuovo la piastra tre volte, utilizzare una micropipetta per aggiungere 100 microlitri di soluzione TMB ELISA.
Incubare la piastra a temperatura ambiente per 30 minuti al buio posizionando la piastra in un cassetto o avvolgendo in un foglio. Quindi aggiungere 100 microlitri di soluzione di arresto. Utilizzare un lettore di lastre per misurare l'OD a 450 nanometri.
Produrre una curva standard misurando l'OD450 di diluizioni seriali di concentrazioni note di acido d-mannuronico. Ripetere le misurazioni due volte ed estrarre un'equazione lineare. Calcolare la concentrazione dell'alginato in ogni campione usando la curva standard e dividere la concentrazione di alginato dall'equazione lineare per OD600 per ottenere la quantità totale di alginato per OD600.
Qui sono mostrati campioni di PAO581 e PAO581 con mutazioni in geni che regolano la biosintesi della pirimidina de novo coltivata su PIA e PIA integrata con 0,1 millimolare di uracile. I dati mostrano che la presenza di uracil nei media si traduce nella conversione del ceppo mutante in mucoidia come visto dalla produzione di alginato restaurata. Qui vengono mostrati i risultati per l'ELISA a base di anticorpi monoclonali anti-alginato.
Le colonie sono coltivate su piastre PIA con arabinosi per l'induzione del promotore PBAD e del plasmide pHERD-20T. Sono mostrati PAO1, PAO1 che porta l'espressione pHERD-20T con il principale algU del fattore sigma specifico alginato, e PAO1 con una cancellazione in-frame del gene algD nella codifica dell'enzima biosintetico alginato chiave GDP-mannosio deidrogenasi. Questi dati confrontano i livelli non mucoidi di alginato misurati per pao1 e pao1 delta algD rispetto ai livelli mucoidi di alginato misurati per PAO1 con algU pHERD-20T.
L'ELISA anti-alginato è stato testato anche su campioni di espettorato del paziente senza crescita preventiva sulle piastre. Tre campioni di espettorato di CF che hanno avuto una crescita di P.aeruginosa mucoide hanno mostrato alginato rilevabile rispetto a due campioni di espettorato del paziente che contenevano P.aeruginosa non mucoide o nessuna crescita di P.aeruginosa. La preparazione delle curve standard per la quantificazione dell'alginato è molto cruciale in quanto ciò consentirà una misurazione precisa e accurata dell'alginato all'interno del campione.
La soluzione acida utilizzata nel metodo carbazolo è molto pericolosa, per cui devono essere utilizzati adeguati dispositivi di protezione individuale e precauzioni per garantire la sicurezza. Dopo aver isolato gli SPV, è possibile fare un ulteriore profilo genetico per comprendere meglio le mutazioni che si verificano e la patogenicità associata a tali mutazioni. Il metodo ELISA può essere adattato per monitorare l'infezione polmonare cronica nei pazienti con fibrosi cistica.
Inoltre, il nostro metodo di crescita potrebbe aiutare a diagnosticare le infezioni causate da specifici SPV.
