Gli approcci proteomici mirati stanno rapidamente diventando il metodo di scelta per la convalida delle proteine da esperimenti basati sulla proteomica a breve termine o da esperimenti basati sulla biologia molecolare. Il monitoraggio delle reazioni multiple è uno di questi approcci mirati che viene sempre più utilizzato per rilevare e quantificare le proteine da campioni biologici. In questo studio abbiamo attraversato i vari passaggi coinvolti nel rilevamento e nella quantificazione delle proteine dal tessuto cerebrale umano con l'intenzione di introdurre i lettori ai requisiti di base di un esperimento MRM.
Pesare circa 50 mg di tessuto cerebrale e lavare il tessuto con 300 microlitri di 1x soluzione salina tamponata con fosfato. Questo passaggio viene eseguito per rimuovere qualsiasi sangue sulla superficie esterna del tessuto, e quindi è consigliabile rimuovere più sangue possibile. Dopo i lavaggi con PBS, aggiungere 300 microlitri di tampone di lisi al tubo contenente il tessuto.
Lisire il tessuto utilizzando un sonicatore a sonda mantenendo il tubo su un bagno di ghiaccio. Continuare con l'omogeneizzazione dei tessuti utilizzando un battitore di perle per perlisi completare il tessuto. Centrifugare il contenuto del tubo a 6000 g per 15 minuti a quattro gradi centigradi.
Trasferire il surnatante in un tubo fresco e mescolare in modo omogeneo. Prendi una piccola aliquota del surnatante e quantifica il contenuto proteico usando un test proteico standard. Qui mostriamo un esempio di stima delle proteine utilizzando Bradford Assay.
Prendi 50 microgrammi di proteine in un tubo di microcentrifuga e riduci il contenuto aggiungendo TCEP in modo tale che la concentrazione finale sia di 20 millimolari. Incubare il contenuto a 37 gradi per un'ora. Dopo l'incubazione, alchilare le proteine ridotte aggiungendo iodoacetammide al tubo, in modo tale che la concentrazione finale sia di 40 millimolari.
Incubare il tubo al buio per 30 minuti. Ora aggiungi il tampone B al tubo contenuto nelle proteine ridotte e alchilate in modo tale che la concentrazione finale di urea sia inferiore a un molare. Aggiungere la tripsina in 1 come a 30 rapporto enzima-proteina e incubare i tubi durante la notte a 37 gradi con agitazione costante.
Dopo la digestione, concentrare i peptidi digeriti in un concentratore di vuoto. In questa fase, i peptidi possono essere ricostituiti e dissattati o conservati a meno 80 per un uso futuro. La desalazione, o pulizia dei peptidi, è essenziale prima di caricare i campioni su qualsiasi LC-MS MS. Sali e altri contaminanti nel campione possono ostruire la colonna e influenzare la sensibilità dello strumento a lungo termine.
Questo processo può essere eseguito utilizzando punte o colonne C18 STAGE disponibili in commercio. Qui abbiamo descritto il flusso di lavoro per la desassazione dei peptidi utilizzando una punta C18 STAGE. Dopo la dissamatrice, asciugare i peptidi in un concentratore a vuoto.
Ricostituire questi peptidi puliti e procedere alla quantificazione utilizzando il metodo Scopes. Per questo, caricare due microlitri del campione in una piastra microgocce e calcolare la concentrazione come mostrato nella diapositiva. La preparazione della lista di transizione è un passo cruciale in un esperimento SRM o MRM.
Un elenco di transizione contiene tutte le informazioni richieste dallo spettrometro di massa per monitorare la transizione. Ciò include i valori m per z degli ioni precursore e prodotto, l'energia di collisione della transizione, la polarità dello strumento e l'intervallo di tempo per l'acquisizione dei dati. Preparare l'elenco di transizione utilizzando Skyline.
Preparare un proteoma di sfondo utilizzando il file Human Proteome Fasta di UniProt e assicurarsi che sia selezionato nella scheda Sfondo di Impostazioni peptidi. Nella scheda Filtro, impostare una lunghezza minima di 8 e una lunghezza massima di 25. Continuare a utilizzare le impostazioni predefinite se non ci sono altre modifiche nei peptidi.
Una volta effettuate le impostazioni peptidiche, fare clic su Impostazioni di transizione. Nella scheda Filtro, impostare i costi precursori su 2 e 3. Impostare le cariche ioniche come 1 e impostare i tipi di ioni su y.
Gli ioni prodotto possono essere selezionati in base alla scelta dell'utente. Lasciare tutti i parametri come predefiniti. Ora inserisci gli id di adesione delle proteine target selezionate.
Questo può essere fatto facendo clic sulla scheda Modifica, quindi selezionando Inserisci e infine incollando gli ID di adesione. Gli ID saranno mappati alle proteine nel proteoma di sfondo e una lista di transizione creata in base alle impostazioni peptidiche e di transizione impostate in precedenza. Esportare questo elenco di transizione.
Assicurarsi che sia selezionato lo strumento giusto facendo clic sull'opzione a discesa Tipo di strumento. In questo caso, lo strumento è Thermo Altis. Poiché l'elenco di transizioni non definito ha troppe transizioni, mantenere un limite di sole 350 transizioni per elenco ed esportare come metodi multipli.
Viene utilizzato un sistema a solvente binario. Il solvente A è 1% FA e il solvente B è 80% ACN. Mantenere la portata a 450 microlitro al minuto e il gradiente come mostrato.
Impostare la temperatura del compartimento della colonna a 45 gradi Celsius. Per ulteriori dettagli sulla colonna e sul sistema LC, fare riferimento al testo. Assicurarsi che le impostazioni MS nel TSQ Altis siano come mostrato qui.
Importare un singolo elenco di transizione per creare un nuovo metodo. Suggeriamo di mantenere la risoluzione per il quadrupolo 1 e il quadrupolo 3 a 7. Questi possono essere ulteriormente ottimizzati se necessario.
Per garantire la coerenza delle esecuzioni e di conseguenza la qualità dei dati, preparare la sequenza di esecuzione come illustrato. Inizia con un paio di spazi vuoti, fai riferimento al testo per la composizione della miscela vuota, seguito da un BSA leggero standard QC di concentrazione nota per monitorare qualsiasi variazione nella risposta diurna dello strumento. Il QC fatto dovrebbe essere appena prima dei campioni.
Quindi allineare tutti i campioni con spazi vuoti in mezzo. Iniettare volumi uguali di ciascun campione, rappresentando da 25 a 1 nanogrammo di peptidi per iniezione. Per creare un metodo raffinato, eseguire prima i metodi non predefiniti su campioni interi.
Importa i risultati in Skyline e controlla manualmente ogni peptide. Per ogni peptide, selezionare un precursore che mostri costantemente buoni picchi in tutti i campioni. Eliminare precursori e peptidi che non mostrano buoni picchi.
Assicurati che tutti i picchi siano annotati correttamente. Per selezionare il picco giusto e perfezionare ulteriormente le transizioni sotto ciascun precursore, è possibile utilizzare una libreria. Una libreria è un insieme di dati spettrali MS-MS abbinati a peptidi e transizioni degli attuali dati sperimentali.
Selezionare picchi con valori DART P più vicini a 1 e rimuovere le transizioni che non corrispondono alla libreria. Un valore DART P indica la qualità della corrispondenza tra il picco sperimentale e il picco della libreria. Dopo uno o due round di ottimizzazione, un elenco raffinato sarà pronto.
Questo elenco raffinato può essere eseguito per singoli campioni. Importa le corse raffinate in Skyline e annota correttamente i picchi. Utilizzare la scheda Annotazione in Impostazioni documento per annotare attentamente ogni esempio nella griglia del documento.
Utilizzare la funzionalità Confronto di gruppo per creare confronti tra la condizione 1 e la condizione 2 dell'esperimento. Questo darà una tabella con i valori P regolati e i valori di modifica della piega tra i due gruppi. Per quanto ne scompariamo, questo è il primo studio che impiega l'uso di MRM per rilevare peptidi per le proteine Apolipoproteina A-1, Vimentina e Nicotinamide fosforibosiltransferasi in campioni di tessuto cerebrale umano.
L'ottimizzazione di vari parametri come il gradiente LC, il tempo di permanenza, il tempo di ciclo e l'energia di collisione può influenzare notevolmente il successo di un esperimento MRM. Riteniamo che questa tecnica possa essere utilizzata per sviluppare modelli di biomarcatori con capacità di distinguere tra diverse condizioni cliniche e malattie.
