Questo protocollo induce l'iperglicemia nei pesci zebra in un modello di aumento e caduta che imita l'iperglicemia che si vede nel diabete di tipo due. Il principale vantaggio di questa tecnica è che è una tecnica non invasiva che consente di garantire che l'iperglicemia sia la causa di eventuali alterazioni osservate nei pesci iperglicemici. Questo protocollo potrebbe potenzialmente essere utilizzato per esplorare vie terapeutiche o farmaci che prendono di mira le complicanze dell'iperglicemia.
Questo protocollo ha molti passaggi, ma quando i passaggi vengono seguiti correttamente e con cura, dovrebbe diventare rapidamente una seconda natura. Ricorda tuttavia, di trattare sempre gli animali delicatamente e umanamente durante l'intero protocollo. Inizia impostando sei carri armati, due per ogni gruppo sperimentale.
Utilizzare serbatoi da due litri, se il numero totale di pesci è inferiore a 20 e quattro litri serbatoi se il numero totale di pesci è superiore a 20. Etichettare uno dei due serbatoi, il serbatoio dell'alloggiamento e l'altro serbatoio della soluzione. Tenere i serbatoi in un bagno d'acqua a 28-29 gradi Celsius per mantenere la temperatura dell'acqua.
Il primo giorno, metti il pesce nelle rispettive soluzioni di trattamento per 24 ore. Il secondo giorno, trasferire il pesce dalle loro soluzioni di trattamento all'acqua per 24 ore. Il terzo giorno, trasferire il pesce dall'acqua alle soluzioni di trattamento.
Continuare questa esposizione alternata per il resto dell'esperimento. Trasferimento quotidiano di pesci di controllo trattati con acqua dall'acqua all'acqua. Assicurarsi che il pesce venga nutrito e trasferito all'interno della stessa finestra di due ore ogni giorno per tutta la durata dell'esperimento.
Trasferire il pesce in ogni gruppo di trattamento dal serbatoio di alloggiamento al serbatoio di soluzione corrispondente utilizzando una rete di pesce standard. Riposizionare il serbatoio contenente il pesce nel bagno d'acqua e sostituire la pietra d'aria e il coperchio del serbatoio. Questo serbatoio è ora il serbatoio dell'alloggiamento e il serbatoio che in precedenza teneva il pesce è ora il serbatoio della soluzione.
Scartare la vecchia soluzione e pulire il serbatoio insieme ai coperchi del serbatoio, alle linee dell'aria, alle pietre d'aria e alle reti per prevenire l'accumulo di glucosio e mannitol. Utilizzare acqua e una spugna dedicata per ogni condizione di trattamento per pulire correttamente i serbatoi. Asciugare i serbatoi di soluzione appena puliti con un tovagliolo di carta e preparare le soluzioni per il giorno successivo utilizzando questo serbatoio.
Assicurarsi che gli altri articoli siano asciugati e separati da gruppi di trattamento appropriati. Per preparare le soluzioni di zucchero, riempire ogni serbatoio della soluzione con due o quattro litri di acqua di sistema. Misurare la corretta quantità di glucosio e mannitol utilizzando una bilancia di carico superiore e barche di pesata separate per ogni sostanza chimica.
Aggiungere l'aliquota pesata di glucosio o mannitol al serbatoio della soluzione pulita appropriato. Mescolare le soluzioni con aste di vetro separate fino a quando gli zuccheri non sono completamente sciolti. Quindi restituire i serbatoi di soluzione al bagno d'acqua e coprirli con i coperchi corrispondenti.
Per preparare la soluzione d'acqua, riempire i serbatoi sperimentali con acqua di sistema Restituire questi serbatoi di soluzione al bagno d'acqua e coprirli con i coperchi corrispondenti. I valori di zucchero nel sangue sono stati significativamente elevati dopo entrambi i trattamenti di glucosio di quattro settimane e otto settimane. Con iperglicemia definita come tre volte le medie di controllo sia dai gruppi trattati con acqua che dal mannitolo.
Il tessuto retinico raccolto dopo quattro settimane di iperglicemia ha avuto un aumento della proteina acida fibrillare gliale o dei livelli di GFAP. L'espressione GFAP è osservata nelle cellule gliali di Mueller nella retina, che sono alterate nella retinopatia diabetica. Questo aumento della GFAP è stato associato ad un aumento dei livelli di kappaB dei fattori nucleari.
Suggerendo che l'iperglicemia indotta innesca una risposta infiammatoria e gliosi reattiva. Le registrazioni ERG dopo quattro settimane di trattamento hanno identificato una diminuzione della risposta nelle retine trattate con glucosio rispetto ai controlli trattati con mannitol. Le ampiezze sia del fotorecettore che dei componenti cellulari bipolari sono state ridotte nei pesci iperglicemici.
Questa procedura può essere integrata da altri test di iperglicemia. Ad esempio, un saggio di memoria può essere usato per esaminare deficit cognitivi o registrare risposte visive come la risposta optomotoria per valutare le complicanze basate sulla visione. Una volta stabilita questa tecnica, il nostro laboratorio è stato in grado di usarla per studiare le complicanze indotte dall'iperglicemia nel modello del pesce zebra.
Abbiamo osservato queste complicazioni relativamente rapidamente, dopo quattro settimane di trattamento.
