Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio dalla Fondazione Famiglia Iacocca, Rosalind Franklin University di start-up dei fondi, e la National Institutes of Health di Grant DK092721 (a RVI). Gli autori desiderano ringraziare Nikki Intine di aiuto nella preparazione del manoscritto.

Tutte le procedure vengono eseguite seguendo le indicazioni riportate in &quot;Principi di cura degli animali da laboratorio&quot; (National Institutes of pubblicazione Sanità n. 85-23, riveduta 1985) e approvato Rosalind Franklin per la cura degli animali dell&#39;Università istituzionale e uso degli animali Comitato protocollo 08-19. Ci sono 2 sigle importanti che vengono utilizzati in questo manoscritto. 1) DM: si riferisce a pesci che si trovano in una acuta (300 mg / dl) stato iperglicemico e sono stati per almeno 3 settimane. 2) MM: si riferisce al pesce che sono stati 21 giorni (vedi protocollo) pesce DM e ha permesso di ripristinare il controllo glicemico attraverso la rigenerazione del pancreas. Questo viene raggiunto entro (14) giorni dalla rimozione del farmaco. I pesci sono considerati pesci MM da questo punto in avanti. E &#39;anche importante notare che il pesce che sono indicati come controllo vengono trattati nello stesso come pesci DM o MM in termini di numero di iniezioni (soluzione salina solo), i tempi di incubazione a temperature diverse e il numero ei tempidelle amputazioni della pinna caudale. 1. Generazione di Zebrafish con diabete mellito, Pesce DM <ol><li> Preparare sia di recupero e serbatoi d&#39;acqua anestetici. Il recupero è acqua pesci di acqua normale. Per l&#39;acqua anestetico sufficiente aggiungere 2-fenossietanolo in modo che un 1:1000 diluizione in pesci di acqua normale è raggiunto. </li><li> Preparare una soluzione di 0,3% (sotto cappa) di streptozocina (STZ) con l&#39;aggiunta di 6 mg di STZ a 2 ml di cloruro di sodio 0,09% e collocare immediatamente la soluzione su ghiaccio. Ciò fornirà soluzione iniettabile sufficiente per l&#39;iniezione di circa 20 pesci in 20 min. Se si supera il segno di 20 minuti, fermarsi, e fare una nuova soluzione STZ prima di procedere. In un altro soluzione aliquota tubo abbastanza salina per pesci di controllo. Una volta che il STZ viene solubilizzato tutti i passaggi successivi non richiedono l&#39;uso dei fumi cappa. </li><li> Riempire una siringa da cc ½ dotata di un ago calibro 27 1/2 con le soluzioni STZ o di controllo che garantiscano l&#39;assenza di bolle d&#39;aria intrappolate. </li><li> AnestesiaTize ogni pesce individualmente mettendo il pesce in acqua anestesia, e attendere che il loro movimento nuoto cessa (1-2 min). </li><li> Una volta brevemente anestetizzato luogo il pesce su un tovagliolo di carta per assorbire l&#39;acqua in eccesso, collocare il pesce in peso dell&#39;imbarcazione e misurare la massa del pesce. </li><li> Mettere il pesce su una superficie stabile (coperchio scatola Petri) per iniezione. </li><li> Iniettare la soluzione di controllo STZ o nella cavità peritoneale del pesce inserendo l&#39;ago passato lo smusso nella faccia posteriore del peritoneo ventrale. </li><li> 0,35 mg / g (350 mg / kg) di STZ dovrebbe essere consegnato a ciascun pesce e il volume della soluzione di 0,3% necessario può essere calcolato nel modo seguente. <ol class="lalpha"><li> Moltiplicare massa di pesce (g) da 0,35 a produrre la quantità di STZ in mg richiesto. </li><li> dividere il prodotto generato sopra del 3 per ottenere il volume della soluzione di 0,3% necessaria per iniezione in microlitri. Esempio: Per un pesce 0,5 g: a) 0,5 x 0,35 = 0,175 b) 0,0175 / 3 = 0,058 ml= 58 microlitri. Lo stesso volume senza STZ sarebbe iniettato per un pesce controllo. Un foglio per volumi da iniettare per massa pesci dovrebbero essere generati e utilizzati per una rapida consultazione. </li></ol></li><li> Dopo l&#39;iniezione mettere il pesce nel serbatoio dell&#39;acqua di recupero e il monitoraggio per l&#39;attività di nuotare normalmente. Una volta che questo è stato raggiunto il pesce viene trasferito in un serbatoio vita normale che viene mantenuta alla temperatura minore di 22 ° C - 24 ° C. Questa temperatura ridotta è critico per l&#39;induzione efficiente di iperglicemia (diabete mellito, DM). </li><li> Sebbene l&#39;iperglicemia viene rilevato entro 24 ore della prima iniezione, al fine di indurre uno stato di iperglicemia prolungata molto elevato il zebrafish richiedono una frequente fase di induzione iniezione seguita da iniezioni settimanali di manutenzione come mostrato di seguito. </li></ol> Settimana 1: 3 iniezioni (giorno 1, 3, 5), Settimana 2: 1 iniezione (giorno 12), Settimana 3: 1 iniezione (giorno 19), Settimana 4: (Giorno 21) Eseguiresaggio di interesse. A questo punto il pesce zebra sono considerati di essere stato in un prolungato stato di iperglicemia e di esporre le complicanze del diabete di retinopatia, nefropatia e la rigenerazione della pinna anche compromessa. Questi sono indicati come pesci DM. Inoltre, se si desidera il pesce può essere mantenuta allo stato iperglicemico con iniezioni settimanali di manutenzione. Circa il 5% la morte nel corso di questo processo dovrebbe essere previsto. 2. Il prelievo di sangue e digiuno livello di glucosio nel sangue (FBGL) Determinazione <ol><li> Ogni gruppo di pesci DM e controllo deve essere composto di pesce sufficiente per determinare con precisione la FBGL media del gruppo in quanto questo test richiede questi pesci per essere sacrificato. </li><li> Preparare una provetta PCR per ciascun campione di sangue contenente 5 ml di soluzione fisiologica sterile. </li><li> Per la raccolta del sangue, anestetizzare i pesci come sopra, togliere tutta l&#39;acqua, mettere il pesce su un vetrino da microscopio e con un bisturi, rimuovere la testa del pescealla base dell&#39;opercolo. </li><li> Raccogliere il sangue (fino a 2 microlitri) che viene rilasciato dal pesce sulla slitta e rapidamente aggiungere al 5 microlitri di soluzione salina normale pipettando su e giù per assicurarsi che il sangue non si intasa. Porre immediatamente il campione in ghiaccio. </li><li> Determinare il volume del campione di sangue misurando il volume totale del liquido (soluzione salina + sangue) e sottraendo il 5 microlitri di soluzione salina. </li><li> Trasferire 5 pl di sangue diluito da ogni provetta PCR in una provetta da microcentrifuga 1,5 ml e determinare la concentrazione di glucosio nel sangue con il QuantiChrome Assay Kit glucosio. Questo viene eseguito seguendo il protocollo del produttore senza eccezione. Risultati attesi: normale / controllo di pesce 60 mg / dl e DM pesce 310 mg / dl. </li></ol> 3. Pinna caudale Rigenerazione Studi <ol><li> Anestetizzare i pesci come descritto nella 1,0-1,4. </li><li> Mettete i pesci su un coperchio piastra di Petri e amputare la pinna caudale in linea retta utilizzando una dimensione sterile10 bisturi prossimale al primo punto lepidotrichia ramificazione durante la visualizzazione della pinna attraverso un microscopio da dissezione. </li><li> Permettere il pesce di recuperare in 1,10 ma posizionare il pesce a 33 ° C per la fase di crescita e la rigenerazione del dosaggio. Questa è una temperatura stabilita per l&#39;analisi accelerata rigenerazione pinna. </li><li> Le alette possono essere ripreso in qualsiasi momento dopo amputazione tuttavia abbiamo routinariamente esaminare la crescita e la rigenerazione a 24, 28 e 72 ore dopo trans-sezione. </li><li> Anestetizzare i pesci come prima (vedi 1,0-1,4), posizionare il pesce sotto un microscopio da dissezione dotato di una fotocamera (si usa una Nikon SMZ-1500 dotato di un Q-imaging telecamera) e raccogliere tutte le immagini finali con ingrandimento 1X con il software NIS elementi . La pinna deve essere diffuso per l&#39;imaging in modo che sia completamente esteso senza tirare o danneggiare il tessuto e deve essere esente da eventuali gocce d&#39;acqua. Per motivi di coerenza è necessario posizionare il lato dorsale a destra. </li><li> Stampa di immagini e misurare la GRO rigenerativaArea wth utilizzando software Image J e l&#39;uso di un foglio da disegno. Tracciare tutta la zona di nuova crescita e determinare l&#39;area. Ogni misurazione deve essere eseguita cinque volte e una media per garantire la precisione di tracciamento. È importante che le immagini utilizzate non hanno ombre o d&#39;acqua da questi errori nella misurazione della superficie outgrowth. </li><li> Misurare la lunghezza del sito amputazione lungo l&#39;asse dorso-ventrale e dividere la superficie determinata in 3,6 da questa misura. Questo permette pesci di diverse dimensioni per essere confrontati direttamente. </li></ol> 4. Generazione di memoria metabolica (MM) Zebrafish <ol><li> Avviare un gruppo di pesci DM e dei loro controlli appropriati come descritto al punto 1. </li><li> A 21 giorni per determinare la FBGL un sottoinsieme del gruppo e dividere il pesce DM in 2 sottogruppi. Continua settimanale STZ iniezioni per uno dei gruppi come controlli DM per la durata dell&#39;esperimento. Cessate iniezione STZ per il secondo gruppo e incubate il pesce a temperatura normale. Entro 14 giorni questi zebrafish ripristinerà il normale insulina nel sangue e il controllo del glucosio attraverso la rigenerazione del pancreas. Questi pesci sono ora chiamati MM (pesce memoria metabolica). </li><li> Al 30 ° giorno dopo la rimozione del farmaco amputare le pinne caudali di controllo, DM e MM pesce tramite il metodo descritto al punto 3.2. </li><li> Ritorno pesce alle condizioni dell&#39;acqua normali per la rigenerazione pinna per 30 giorni. Questo permette la crescita di ciò che chiamiamo, tessuto della memoria metabolica. </li><li> Al giorno 60 eseguire una seconda amputazione (come descritto in 3.2) all&#39;interno del tessuto che è stato rigenerato nel periodo 30-60 giorni ed eseguire la rigenerazione pinna caudale dosaggio (3,1-3,7) Figura 1. </li><li> Isolare tessuto ed eseguire analisi di interesse. Vedi Tabella 1 per una sintesi protocollo. </li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il diabete mellito è una malattia di alterazioni metaboliche, inizialmente diagnosticati come l&#39;iperglicemia, che in ultima analisi, i danni dei vasi sanguigni che porta a molte complicazioni che tutti persistono anche dopo euglicemia è ottenuta mediante intervento farmaceutico. Tale persistenza di complicazioni è chiamata memoria metabolica e diversi studi recenti hanno esaminato il ruolo che meccanismi epigenetici svolgere in questo fenomeno. Qui abbiamo descritto un protocollo che permette la generazione di en...

Il diabete mellito (DM) è un problema di salute grave e crescente che si traduce in riduzione dell&#39;aspettativa di vita a causa di malattia microvascolare specifica (retinopatia, nefropatia, neuropatia, la guarigione delle ferite) e macrovascolari (malattie cardiache e ictus) complicazioni 1. Una volta avviato, complicanze del diabete continuare a progredire senza interruzioni, anche quando il controllo glicemico si ottiene 2,3 e questo fenomeno è stato chiamato memoria metabolica o l&#39;effetto legacy. La presenza di questo fenomeno è stato riconosciuto clinicamente nei primi anni 1990 come &quot;The Diabetes Control and Complications Trial (DCCT)&quot; progredito e poiché è stata sostenuta da diversi studi clinici aggiuntivi 4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Modelli animali di DM sono stati critici per le scoperte relative alla fisiopatologia delle complicanze del diabete e della memoria metabolica. Infatti, la persistenza di complicanze diabetiche è documentata in un modello canino di diabeticaretinopatia che da allora è stata sostenuta da diverse linee di evidenze sperimentali utilizzando una varietà di sistemi di coltura in vitro e su modelli animali 15,16,17,18,19,20,21. Questi studi mostrano chiaramente che un primo risultato iperglicemici periodo nelle anomalie permanenti (compresa l&#39;espressione genica aberranti) di organi bersaglio / cellule e meccanicamente suggerisce il coinvolgimento del epigenoma. Epigenomes costituiti da tutte le modificazioni della cromatina per un dato tipo di cellula e sono responsabili profilo unico gene di una cellula espressione. Le modifiche cromosomiche sono dinamiche durante lo sviluppo, differenziamento supporto cellulare, sono sensibili agli stimoli esterni, sono mitoticamente stabilmente ereditati 22,23 e può essere modificato in malattia 24,25,26. Questi meccanismi epigenetici includono: inviare traduzionali modificazioni degli istoni, non canonico inclusione variante dell&#39;istone in octomers, i cambiamenti di accesso cromatina tramite metilazione del DNA e genicontrollo dell&#39;espressione attraverso RNA non codificanti micro 27,28,29,30. Nel complesso, i processi epigenetici consentono alle cellule / organismi di rispondere rapidamente alle mutevoli stimoli ambientali 31,32,33, hanno anche la possibilità di conferire alla cellula di &quot;memorizzare&quot; questi incontri una volta lo stimolo viene rimosso 23,22. Pertanto, come alterati profili di espressione genica derivanti da processi epigenetici sono stabili in assenza di segnale (s) che li avviato e sono ereditarie attraverso la divisione cellulare, hanno guadagnato grande interesse come base dei meccanismi molecolari di patologie umane quali memoria metabolica. I risultati che stanno emergendo nel contesto di DM e dell&#39;epigenetica progressi paralleli in altre malattie in quanto una pletora di modifiche epigenetiche indotte da iperglicemia causare notevoli cambiamenti persistenti nelle reti trascrizionali di cellule (recensione in 34,35,36,37,38). Il pesce zebra è stato a lungo un organismo modello premier a study sviluppo dei vertebrati tuttavia negli ultimi 15 anni ha visto una crescita esponenziale nell&#39;utilizzo questo organismo per lo studio delle malattie umane. 39. Zebrafish modelli di malattie umane sono state stabilite coprono una vasta gamma di patologie umane quali i disordini genetici e malattie acquisite 40,41,42. I molti vantaggi del pesce zebra su altri organismi modello vertebrati comprendono alta fecondità, tempo di generazione breve, la trasparenza attraverso la prima età adulta, le spese di alloggio ridotti e una serie di strumenti per la manipolazione genetica. Inoltre, a causa della conservazione estesa di percorsi genetici e della fisiologia cellulare tra i vertebrati e la capacità di eseguire elevate proiezioni di droga di throughput, il pesce zebra è stato utilizzato con successo per la scoperta farmaceutica. Abbiamo sviluppato un modello di zebrafish adulto di tipo I diabete mellito con il farmaco diabetogeno, streptozocina. Abbiamo caratterizzato questo modello per dimostrare che zebrafish diabetico nont visualizzare solo le note complicazioni secondarie umani, ma in aggiunta, esporre rigenerazione compromissione dell&#39;arto (rigenerazione caudale) come conseguenza dell&#39;ambiente iperglicemici. Inoltre, abbiamo riportato che zebrafish iperglicemico tornare alla glicemia normale entro 2 settimane dalla rimozione del farmaco a causa di rigenerazione delle cellule beta pancreatiche endogene con conseguente stato glicemico fisiologicamente normale. Tuttavia, in contrasto, rigenerazione degli arti in questi pesci resta compromessa nella stessa misura come nello stato diabetico acuto indica tale complicanza persiste ed è suscettibile di memoria metabolica. L&#39;impulso principale per la generazione di questo modello è di fornire un sistema per studiare le componenti mitoticamente stabili epigenetici che supportano il fenomeno metabolico memoria in assenza del rumore di fondo dell&#39;ambiente iperglicemico precedente. Alla conclusione del protocollo fornito qui i tessuti e zebrafish o selettivi possono essere elaborati da qualsiasi saggio adatto al researchers bisogno. Abbiamo utilizzato con successo questa procedura per identificare i cambiamenti persistenti genoma nella metilazione del DNA indotte da iperglicemia che sono mantenuti nello stato di memoria metabolica 21. Riteniamo che questo modello zebrafish di tipo I diabete mellito ha diversi vantaggi rispetto ai sistemi innovativi altri modelli per l&#39;esame della memoria metabolica. 1) Tutti i nostri studi possono essere condotti in vivo e come il pesce iperglicemico precedente tornare euglicemia attraverso la rigenerazione della produzione di insulina endogena, non richiedono iniezioni di insulina esogena. Pertanto, questo evita i picchi e le valli complicanti controllo glicemico che possono verificarsi negli animali richiedono insulina esogena. 2) Come descritto sopra, la stimolazione sfondo dallo stato diabetico precedente (cioè la presenza continua di glicazione avanzata prodotti finali e specie di ossigeno reattive marcatori) sono eliminati e quindi si può esaminare l&#39;puramente epigfattori enetic della memoria metabolica. 3) Gli esperimenti possono essere eseguiti rapidamente come ci vogliono circa 80 giorni dalla induzione di diabete fino al momento dell&#39;analisi della memoria metabolica. 4) la rigenerazione pinna caudale è sperimentalmente molto accessibile e permette un facile manipolazione genetica e sperimentale per i quali ci sono una vasta gamma di strumenti. 5) rigenerazione Pinna caudale fornisce un metodo molto semplice e quantificabili per valutare la memoria metabolica e quindi permetterà la scoperta di farmaci futuro.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Streptozocina </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S0130 </td><td></td></tr><tr><td> 2 fenossietanolo </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P1126 </td><td></td></tr><tr><td> Scalpel (taglia 10) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 089275A </td><td></td></tr><tr><td> Petri Piatti </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-757-13 </td><td></td></tr><tr><td> ½ cc siringa, con 27 1/2 gauge </td><td> Fisher Scientific </td><td> 305620 </td><td></td></tr><tr><td> QuantiChrome Glucose test kit. </td><td> Sistemi di saggi biologici </td><td> Digl-100 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro di sodio </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td> Dissezione Microscopio </td><td> Nikon </td><td> TMZ-1500 </td><td> Ogni microscopio da dissezione va bene. </td></tr><tr><td> Telecamera per immagini </td><td> Nikon </td><td> Q di imaging </td><td> Ogni telecamera è adatta. </td></tr><tr><td> Immagine J software </td><td> National Institutes of Health </td><td> NIH Image </td><td></td></tr><tr><td> NIS Elements </td><td> Nikon </td><td></td><td> Qualsiasi software di imaging è adatto. </td></tr></tbody></table>

a zebrafish model of diabetes mellitus and metabolic memory

Il diabete mellito colpisce attualmente 346 milioni gli individui e questo si prevede un aumento a 400 milioni entro il 2030. Le prove sia dal laboratorio e ampi studi clinici scala ha rivelato che il progresso complicazioni diabetiche senza impedimenti attraverso il fenomeno della memoria metabolica, anche quando il controllo glicemico è farmaceuticamente raggiunto. L&#39;espressione genica può essere stabilmente alterata attraverso cambiamenti epigenetici che non solo permettono cellule e organismi di rispondere rapidamente alle mutevoli stimoli ambientali ma anche conferire la capacità della cella per &quot;memorizzare&quot; una volta che questi incontra lo stimolo viene rimosso. Come tale, i ruoli che questi meccanismi giocano nel fenomeno memoria metabolica sono attualmente allo studio. Abbiamo recentemente riportato lo sviluppo di un modello di zebrafish di tipo I diabete mellito e caratterizzato questo modello per dimostrare che zebrafish diabetico non solo visualizzare le note complicazioni secondarie, tra cui i cambiamenti associaticon la retinopatia diabetica, la nefropatia diabetica e la guarigione delle ferite, ma anche esporre compromessa la rigenerazione pinna caudale. Questo modello è unico in quanto il pesce zebra è in grado di rigenerare il suo pancreas danneggiato e ripristinare uno stato euglicemico simile a quello che ci si aspetterebbe in pazienti umani post-trapianto. Inoltre, vari cicli di amputazione caudale consentire la separazione e lo studio di puri effetti epigenetici in un sistema in vivo senza potenziali complicazioni dal precedente stato diabetico. Anche se euglicemia si ottiene seguendo la rigenerazione del pancreas, la complicazione diabetica secondaria di rigenerazione pinna e la guarigione delle ferite della pelle persiste indefinitamente. Nel caso di rigenerazione fin alterata, questa patologia viene mantenuta anche dopo vari cicli di rigenerazione fin nei tessuti viene indicata l&#39;esatta figlia. Queste osservazioni indicano un sottostante processo epigenetico esistente nello stato di memoria metabolica. Qui vi presentiamo i metodi necessari per successo generazionemoderata dei gruppi di memoria diabetici e metabolici di pesce e discutere i vantaggi di questo modello.

Diabetico di tipo I zebrafish non solo visualizzare le complicazioni note secondarie di retinopatia e nefropatia, ma anche, mostrano un ulteriore complicazione: ridotta rigenerazione pinna caudale. Questa complicanza in seguito persiste a causa della memoria metabolica nei pesci che hanno ripristinato il controllo normale di glucosio dopo un periodo di iperglicemia. In Figura 2A (controllo) e Figura 2B (memoria metabolica) immagini rappresentative di pinne rigenerazione catturate a 72 o...

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A Zebrafish Model of Diabetes Mellitus and Metabolic Memory

Memoria metabolica è il fenomeno per cui complicanze diabetiche persistono e progredire senza ostacoli anche dopo euglicemia si ottiene farmaceutico. Qui si descrive un modello di diabete mellito zebrafish che è unica in quanto permette di esame dei componenti mitoticamente trasmissibili epigenetiche di memoria metabolica<em&gt; In vivo</em&gt;.

Un modello Zebrafish di diabete mellito e di memoria metabolica

Diabetes mellitus currently affects 346 million individuals and this is projected to increase to 400 million by 2030. Evidence from both the laboratory ...

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25.5K Views.  Rosalind Franklin University of Medicine and Science. Memoria metabolica è il fenomeno per cui complicanze diabetiche persistono e progredire senza ostacoli anche dopo euglicemia si ottiene farmaceutico. Qui si descrive un modello di diabete mellito zebrafish che è unica in quanto permette di esame dei componenti mitoticamente trasmissibili epigenetiche di memoria metabolica In vivo.

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Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Genomic studies of human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered in tumors1,2,3. A challenge arising from these studies is that many genes are altered, and it can be difficult to distinguish genetic alterations that drove tumorigenesis from that those arose incidentally during transformation. To draw this distinction it is beneficial to have an assay that can quantitatively measure the effect of an altered gene on tumor initiation and other processes that enable tumors to persist and disseminate. Here we present a rapid means to screen large numbers of candidate melanoma modifiers in zebrafish using an autochthonous tumor model4 that encompasses steps required for melanoma initiation and maintenance. A key reagent in this assay is the miniCoopR vector, which couples a wild-type copy of the mitfa melanocyte specification factor to a Gateway recombination cassette into which candidate melanoma genes can be recombined5. The miniCoopR vector has a mitfa rescuing minigene which contains the promoter, open reading frame and 3'-untranslated region of the wild-type mitfa gene. It allows us to make constructs using full-length open reading frames of candidate melanoma modifiers. These individual clones can then be injected into single cell Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)zebrafish embryos. The miniCoopR vector gets integrated by Tol2-mediated transgenesis6 and rescues melanocytes. Because they are physically coupled to the mitfa rescuing minigene, candidate genes are expressed in rescued melanocytes, some of which will transform and develop into tumors. The effect of a candidate gene on melanoma initiation and melanoma cell properties can be measured using melanoma-free survival curves, invasion assays, antibody staining and transplantation assays.

A rapid way to screen for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model is presented. It takes advantage of the miniCoopR vector which allows for expression of candidate melanoma genes in melanocytes. A method to obtain melanoma-free survival curves, an invasion assay, a protocol for antibody staining of scale melanocytes and a melanoma transplantation assay are described.

Screening per Modificatori melanoma utilizzando un modello Zebrafish Tumore autoctone

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

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A Model of Chronic Nutrient Infusion in the Rat

Chronic exposure to excessive levels of nutrients is postulated to affect the function of several organs and tissues and to contribute to the development of the many complications associated with obesity and the metabolic syndrome, including type 2 diabetes. To study the mechanisms by which excessive levels of glucose and fatty acids affect the pancreatic beta-cell and the secretion of insulin, we have established a chronic nutrient infusion model in the rat. The procedure consists of catheterizing the right jugular vein and left carotid artery under general anesthesia; allowing a 7-day recuperation period; connecting the catheters to the pumps using a swivel and counterweight system that enables the animal to move freely in the cage; and infusing glucose and/or Intralipid (a soybean oil emulsion which generates a mixture of approximately 80% unsaturated/20% saturated fatty acids when infused with heparin) for 72 hr. This model offers several advantages, including the possibility to finely modulate the target levels of circulating glucose and fatty acids; the option to co-infuse pharmacological compounds; and the relatively short time frame as opposed to dietary models. It can be used to examine the mechanisms of nutrient-induced dysfunction in a variety of organs and to test the effectiveness of drugs in this context.

A protocol for chronic infusions of glucose and Intralipid in rats is described. This model can be used to study the impact of nutrient excess on organ function and physiological parameters.

Un modello del Chronic Infusion nutrienti nel ratto

Chronic exposure to excessive levels of nutrients is postulated to  affect the function of several organs and tissues and to contribute to the  ...

A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. Urinary exosome vesicles, 40-100 nm in size, are released into the urine under normal conditions by cells from all nephron segments and may contain protein, mRNA and microRNA representative of their cell type of origin. Under conditions of renal dysfunction or injury, exosomes may contain altered proportions of these components, which may serve as biomarkers for disease. There are currently several methods available for isolation of urinary exosomes, and we have previously conducted an experimental comparison of each of these approaches, including three based on ultracentrifugation, one using a nanomembrane ultrafiltration concentrator, one using a commercial precipitation reagent and one using a modification of the precipitation technique using ExoQuick reagent that we developed in our laboratory. We found the modified precipitation method produced the highest yield of exosome particles, miRNA, and mRNA, making this approach suitable for the isolation of exosomes for subsequent RNA profiling. We conclude that the modified exosome precipitation method offers a quick, scalable, and effective alternative for the isolation of exosomes from urine. In this report, we describe our modified precipitation technique using ExoQuick reagent for isolating exosomes from human urine.

This manuscript describes a protocol for isolating exosomes from human urine using a modified precipitation technique.

Un metodo di precipitazione modificata per isolare urinaria Esosomi

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG - and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to &#8220;off-target&#8221; effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.

Un possibile modello Zebrafish della malattia del rene policistico: Knockdown di<em&gt; Wnt5a</em&gt; Provoca cisti in Zebrafish Reni

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Surgical Injury to the Mouse Pancreas through Ligation of the Pancreatic Duct as a Model for Endocrine and Exocrine Reprogramming and Proliferation

Expansion of pancreatic beta cells in vivo or ex vivo, or generation of beta cells by differentiation from an embryonic or adult stem cell, can provide new expandable sources of beta cells to alleviate the donor scarcity in human islet transplantation as therapy for diabetes. Although recent advances have been made towards this aim, mechanisms that regulate beta cell expansion and differentiation from a stem/progenitor cell remain to be characterized. Here, we describe a protocol for an injury model in the adult mouse pancreas that can function as a tool to study mechanisms of tissue remodeling and beta cell proliferation and differentiation. Partial duct ligation (PDL) is an experimentally induced injury of the rodent pancreas involving surgical ligation of the main pancreatic duct resulting in an obstruction of drainage of exocrine products out of the tail region of the pancreas. The inflicted damage induces acinar atrophy, immune cell infiltration and severe tissue remodeling. We have previously reported the activation of Neurogenin (Ngn) 3 expressing endogenous progenitor-like cells and an increase in beta cell proliferation after PDL. Therefore, PDL provides a basis to study signals involved in beta cell dynamics and the properties of an endocrine progenitor in adult pancreas. Since, it still remains largely unclear, which factors and pathways contribute to beta cell neogenesis and proliferation in PDL, a standardized protocol for PDL will allow for comparison across laboratories.

This protocol describes an injury model involving the surgical ligation of the pancreatic duct in the adult mouse pancreas, resulting in severe injury that establishes an environment that allows beta cell neogenesis and proliferation. This model can be used as a tool to study mechanisms involved in beta cell formation.

Lesioni chirurgica al pancreas mouse attraverso la legatura del Dotto pancreatico come un modello per Endocrine e Esocrine riprogrammazione e la proliferazione

Expansion of pancreatic beta cells in vivo or ex vivo, or generation of beta cells by differentiation from an embryonic or adult stem cell, can provide ...

Ferric Chloride-induced Thrombosis Mouse Model on Carotid Artery and Mesentery Vessel

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric chloride injury is now a well-established technique to rapidly and accurately induce the formation of thrombi in exposed veins or artery of small and large diameter. This model has played a key role in the study of the pathophysiology of thrombosis, in the discovery and validation of novel antithrombotic drugs and in the understanding of the mechanism of action of these new agents. Here, the implementation of this technique on a mesenteric vessel and carotid artery in mice is presented. The method describes how to label circulating leukocytes and platelets with a fluorescent dye and to observe, by intravital microscopy on the exposed mesentery, their accumulation at the injured vessel wall which leads to the formation of a thrombus. On the carotid artery, the occlusion caused by the clot formation is measured by monitoring the blood flow with a Doppler probe.

The FeCl3 induced thrombosis model in mice is described herein. A method to monitor thrombus growth by intravital microscopy observation on a mesenteric vessel and by blood flow measurement in the carotid artery is presented.

Cloruro ferrico-indotta Trombosi modello murino sulla carotide e Mesentere Vessel

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric ...

Dissection of the Mouse Pancreas for Histological Analysis and Metabolic Profiling

We have been investigating the pancreas specific transcription factor, 1a cre-recombinase; lox-stop-lox- Kristen rat sarcoma, glycine to aspartic acid at the 12 codon (Ptf1acre/+;LSL-KrasG12D/+) mouse strain as a model of human pancreatic cancer. The goal of our current studies is to identify novel metabolic biomarkers of pancreatic cancer progression. We have performed metabolic profiling of urine, feces, blood, and pancreas tissue extracts, as well as histological analyses of the pancreas to stage the cancer progression. The mouse pancreas is not a well-defined solid organ like in humans, but rather is a diffusely distributed soft tissue that is not easily identified by individuals unfamiliar with mouse internal anatomy or by individuals that have little or no experience performing mouse organ dissections. The purpose of this article is to provide a detailed step-wise visual demonstration to guide novices in the removal of the mouse pancreas by dissection. This article should be especially valuable to students and investigators new to research that requires harvesting of the mouse pancreas by dissection for metabolic profiling or histological analyses.

This video article provides a detailed demonstration of the procedures required to successfully remove the pancreas from a mouse by dissection for histological analysis and metabolic profiling.

Dissezione del Pancreas del Mouse per l'analisi istologica e Profiling metabolico

We have been investigating the pancreas specific transcription factor, 1a cre-recombinase; lox-stop-lox- Kristen rat sarcoma, glycine to aspartic acid at ...

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of diabetic microvascular complications one of the key research fields of the next decades. Specialized, targeted therapy and novel therapeutic drugs are needed to manage the increasing number of patients at risk of vision-loss. The zebrafish is an established animal model for developmental research questions with increasing relevance for modeling metabolic multifactorial disease processes. The advantages of the species allow for optimal visualization and high throughput drug screening approaches, combined with the strong ability to knock out genes of interest. Here, we describe a protocol which will allow easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis or vessel damage. This is achieved via dissection of the zebrafish retina and whole-mounting of the tissue. Visualization of the exposed vessels is then achieved via confocal microscopy of the green EGFP reporter expressed in the adult retinal vasculature. Correct handling of the tissue will lead to better outcomes and less internal vessel breakage to assure the visualization of the unaltered vascular structure. The method can be utilized in zebrafish models of retinal vasculopathy linked to changes in the vessel architecture as well as neoangiogenesis.

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tgfli:EGFP Zebrafish Retinal Vasculature

Here, we discuss a method protocol which will allow an easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis and structural changes.

Lo studio diabete Through the Eyes of un pesce: Microdissection, visualizzazione e analisi della tg(fli:EGFP) adulto Vasculature retinico Zebrafish

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of ...

Body Composition and Metabolic Caging Analysis in High Fat Fed Mice

Alterations to body composition (fat or lean mass), metabolic parameters such as whole-body oxygen consumption, energy expenditure, and substrate utilization, and behaviors such as food intake and physical activity can provide important information regarding the underlying mechanisms of disease. Given the importance of body composition and metabolism to the development of obesity and its subsequent sequelae, it is necessary to make accurate measures of these parameters in the pre-clinical research setting. Advances in technology over the past few decades have made it possible to derive these measures in rodent models in a non-invasive and longitudinal fashion. Consequently, these metabolic measures have proven useful when assessing the response of genetic manipulations (for example knockout or transgenic mice, viral knock-down or overexpression of genes), experimental drug/compound screening and dietary, behavioral or physical activity interventions. Herein, we describe the protocols used to measure body composition and metabolic parameters using an animal monitoring system in chow-fed and high fat diet-fed mice.

This protocol describes the use of a body composition analyzer and metabolic animal monitoring system to characterize body composition and metabolic parameters in mice. An obesity model induced by high-fat feeding is used as an example for the application of these techniques.

Analisi metabolica ingabbiamento in topi alta Fed grasso e della composizione corporea

Alterations to body composition (fat or lean mass), metabolic parameters such as whole-body oxygen consumption, energy expenditure, and substrate ...

A Doxorubicin-induced Cardiomyopathy Model in Adult Zebrafish

The genetically accessible adult zebrafish (Danio rerio) has been increasingly used as a vertebrate model for understanding human diseases such as cardiomyopathy. Because of its convenience and amenability to high throughput genetic manipulations, the generation of acquired cardiomyopathy models, such as the doxorubicin-induced cardiomyopathy (DIC) model in adult zebrafish, is opening the doors to new research avenues, including discovering cardiomyopathy modifiers via forward genetic screening. Different from the embryonic zebrafish DIC model, both initial acute and later chronic phases of cardiomyopathy can be determined in the adult zebrafish DIC model, enabling the study of stage-dependent signaling mechanisms and therapeutic strategies. However, variable results can be obtained with the current model, even in the hands of experienced investigators. To facilitate future implementation of the DIC model, we present a detailed protocol on how to generate this DIC model in adult zebrafish and describe two alternative ways of intraperitoneal (IP) injection. We further discuss options on how to reduce variations to obtain reliable results and provide suggestions on how to appropriately interpret the results.

A method to generate a doxorubicin-induced cardiomyopathy model in adult zebrafish (Danio rerio) is described here. Two alternative ways of intraperitoneal injection are presented and conditions to reduce variations among different experimental groups are discussed.