Questo metodo può essere utilizzato per identificare e caratterizzare elementi regolatori che controllano la traduzione durante la maturazione degli ovocite. Abbiamo applicato la microscopia time-lapse per valutare l'accumulo di reporter durante la maturazione degli ovocici in vitro. Ciò individua con precisione il momento in cui l'attivazione traslazione o la repressione avviene durante la maturazione degli ovocite.
Per iniziare, aprire attentamente i follicoli astrali facendo un piccolo taglio nella parete del follicolo con un ago calibro 26. Isolare i COC intatti con diversi strati di cellule cumuli utilizzando una pipetta di vetro azionata dalla bocca. Utilizzare una pipetta più piccola e denudare meccanicamente i COC mediante pipettazione ripetuta.
Aspirare gli ovociti denudati e metterli in una piastra di Petri con mezzo di maturazione integrato con un micromolare di cilostamide. Mettere il piatto in un'incubatrice per due ore per lasciare che gli ovociti si riprendano dallo stress indotto dal loro isolamento dai follicoli. Posizionare un tubo capillare in vetro borosilicato lungo 10 centimetri in un estrattore meccanico per preparare aghi di iniezione.
Piegare la punta dell'ago con un angolo di 45 gradi utilizzando un filamento riscaldato per un'iniezione ottimale. Posizionare 20 goccioline di microliter di mezzo di raccolta di ovocite di base in un piatto di polistirolo e coprire le goccioline con olio minerale leggero. Preparare un volume maggiore di mix di reporter aggiungendo 12,5 microgrammi per microlitro di Ypet UTR e mCherry ciascuno.
Memorizzare le aliquote di questi a meno 80 gradi Celsius. Dopo lo scongelamento, centrifugare l'aliquota per due minuti a 20.000 volte G, quindi trasferirla in un nuovo tubo di microcentrifugo. Caricare l'ago di iniezione con circa 0,5 microlitri di miscela di reporter.
Posizionare la pipetta di tenuta e l'ago di iniezione nei supporti e posizionarli nella goccia del mezzo di raccolta degli ovocite. Aprire l'ago di iniezione toccandolo delicatamente contro la pipetta di tenuta. Metti gli ovociti in una goccia di mezzo di raccolta di base e inietta da cinque a 10 picoliter del mix di reporter.
Incubare gli ovociti e il mezzo di maturazione con una cilostamide micromolare per 16 ore per consentire al segnale mCherry di stabilizzarsi. Per la microscopia time-lapse, preparare una piastra di Petri con due goccioline da 20 microliter di mezzo di maturazione per ogni reporter iniettato, una goccia con una cilostamide micromolare per il controllo degli ovociti arrestati con prophase I e una goccia senza cilostamide per gli ovociti in maturazione. Coprire le goccioline con olio minerale leggero e posizionarle nell'incubatrice.
Dopo la pre-incubazione, rimuovere gli ovociti iniettati dall'incubatrice e lavarli quattro volte in mezzo di maturazione senza cilostamide. Mantenere alcuni ovociti in mezzo di maturazione con una cilostamide micromolare come gruppo di controllo degli ovociti prophase I. Trasferire gli ovociti iniettati nelle rispettive goccioline sul piatto del microscopio time-lapse precedentemente preparato.
Raggruppare gli ovociti con una pipetta di vetro chiusa per impedirne il movimento durante la registrazione. Posizionare il piatto al microscopio dotato di un sistema di eliminazione del diodo emettitore di luce e di uno stadio motorizzato dotato di una camera ambientale mantenuta a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica, utilizzando i parametri menzionati nel manoscritto testuale. Immettere le impostazioni appropriate per l'esperimento time-lapse facendo clic su App e quindi su Acquisizione multidimensionale.
Selezionare la prima scheda Principale e selezionare time-lapse, posizioni di più fasi e lunghezze d'onda multiple. Selezionare la scheda Salvataggio per immettere la posizione in cui salvare l'esperimento. Selezionare quindi la tabulazione Time-Lapse per immettere il numero di punti di tempo, la durata e l'intervallo di tempo.
Selezionare la scheda Stage, attivare brightfield e individuare la posizione degli ovociti aprendo una nuova finestra e selezionando Acquisisci, Acquisisci e Mostra in diretta. Una volta localizzati gli ovociti, tornare alla finestra di acquisizione multidimensionale e premere più per impostare la posizione degli ovociti. Selezionate le lunghezze d'onda della scheda e impostate tre diverse lunghezze d'onda per brightfield, YFP e mCherry.
Regolate l'esposizione per Ypet e mCherry, quindi iniziate l'esperimento time-lapse facendo clic su Acquisisci (Acquire). Per l'analisi di Ypet tre prime traslazioni UTR, eseguire due misurazioni della regione per ogni ovocita, l'ovocita stessa facendo clic sulla regione dell'ellisse e una piccola regione che circonda l'ovocita da utilizzare per la sottrazione di sfondo facendo clic sulla regione rettangolare. Esportare i dati di misurazione dell'area in un foglio di calcolo facendo clic su Apri registro e quindi su Registra dati.
Per ogni singolo ovocita e per tutti i punti di tempo misurati, sottrarre la misurazione della regione di sfondo dalla misurazione della regione degli ovocite separatamente per le lunghezze d'onda YFP e mCherry. L'espressione di mCherry e YFP in prophase I e ovociti in maturazione è stata registrata in 39 ovociti, di cui 30 sono stati maturati, e nove sono stati arrestati in prophase I come controllo negativo. I rapporti individuali da YFP a mCherry per i segnali di ovociti prophase I arrestati e in maturazione sono stati corretti per il volume iniettato dividendo il segnale YFP per il segnale mCherry medio degli ultimi 10 punti di tempo per gli ovociti prophase I-arrestati e in scadenza.
I tassi di traduzione del reporter YFP sono stati misurati in curva adattando i rapporti YFP a mCherry in prophase I e negli ovociti in maturazione durante il primo zero a due ore, o da otto a 10 ore dopo il rilascio di cilostamide usando la regressione lineare. L'accumulo del reporter non segue uno schema lineare, come indicato da una significativa differenza nei tassi di traduzione tra zero e due ore e da otto a 10 ore dopo il rilascio di cilostamide, indicando l'attivazione della traduzione dell'interleuchina 7 durante la maturazione miotica degli ovocite. Quando si tenta questo protocollo, assicurarsi che il tempo di esposizione sia adeguato all'inizio della registrazione.
Tieni presente che il segnale potrebbe saturarsi durante il corso di tempo se la traduzione viene attivata durante la ripresa meiotica degli ovocite. La stabilità dell'MRMA può essere confermata dalla PCR, utilizzando primer per YFP. Per confermare i cambiamenti nella traduzione, è possibile utilizzare western blotting con un anticorpo contro una tecnologia V5.
