La neurodenegrazione in molti disturbi neurologici è un processo cronico di cui la perdita di fibre neuronali si verifica spesso prima della perdita del corpo cellulare. La quantificazione stereologica delle fibre neuronali in tre dimensioni fornisce un metodo sensibile e accurato per rilevare i primi cambiamenti neurodegenerativi. Questa tecnologia utilizza il frazionamento imparziale affidabile ed efficiente basato su computer delle palle spaziali per misurare le lunghezze di strutture simili a linee come le fibre neuronali in 3D.
A dimostrare la procedura saranno Prabhakar Singh, un post-doc e il nostro esperto di stereologia, e David Peng, l'assistente di ricerca nel mio laboratorio. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al riflesso del pedale nel topo anestetizzato, perfondere trascardialmente con circa 50 millilitri di DPBS molare ghiacciato 0,1, seguito da circa 25 millilitri di 4%PFA in 0,1 PBS molare. Alla fine della perfusione, post-fissare il cervello in un contenitore di 4%PFA fresco per 24 ore a quattro gradi Celsius.
Il giorno dopo, lavare il cervello con tre lavaggi da uno a due minuti in DPBS fresco per lavaggio e trasferire il cervello in un saccarosio del 15% in soluzione DPBS 0.1 durante la notte. La mattina seguente, metti il cervello in una soluzione di saccarosio al 30% e 0,1 DPBS molare per 48 ore a quattro gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione, trasferire il cervello in una camera criotoma pre-impostata a meno 20 gradi Celsius.
Il cervello può essere tenuto in tubi sigillati e conservato a meno 80 gradi Celsius. Per il sezionamento, incorporare il campione di tessuto in un mezzo di incorporamento ottimale della temperatura di taglio e montare il campione su un disco campione. Quindi acquisire sezioni seriali spesse 30 micrometri in un piano coronale nel criotomo, trasferendo ogni sezione in singoli pozzi di una piastra di coltura di 24 porri contenente soluzione crioprotettiva in preparazione per lo stoccaggio di meno 20 gradi Celsius.
Per identificare la prima e l'ultima sezione di ogni cervello, confrontare le caratteristiche morfologiche con un atlante cerebrale standard del mouse. NBM inizia da bregma meno 0,0 millimetri e termina a meno 1,6 millimetri. La selezione di ogni ottava sezione produce un totale di sei-sette sezioni e consente un coefficiente di errore appropriato sia per una stima del volume che della lunghezza della fibra.
Per l'etichettatura immunoistochimica delle sezioni tissutali, dopo aver bloccato qualsiasi legame non specifico con siero bovino normale al 10% nello 0,1%Tritone X-100 nella soluzione salina tamponata da Tris, etichettare le sezioni con l'anticorpo primario di interesse per 48 ore a quattro gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, lavare le sezioni tre volte per tre minuti in soluzione salina tris-tamponata fresca per lavaggio, seguita da incubazione con un anticorpo secondario biotinilato appropriato per un'ora a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, lavare le sezioni tre volte in soluzione salina tris-tamponata fresca come dimostrato, seguita dalla colorazione con complesso di perossidasi di biotina Avidin e soluzione di substrato perossidasi DAB secondo i protocolli del produttore.
Dopo il lavaggio, montare tutte le sezioni da un campione di tessuto cerebrale su uno scivolo gelatinizzato e lasciare asciugare i campioni all'aria. Per disidratare le sezioni, immergere i campioni due volte per cinque minuti per diluizione in soluzioni sequenziali ascendenti di etanolo come indicato, seguita da schiaritura con due lavaggi in xilene di 10 minuti. Quindi utilizzare un mezzo di montaggio appropriato per posizionare le copertine sulle diapositive.
Per la stereologia, aprire un nuovo studio nel software. Si aprirà una finestra di dialogo per l'inizializzazione dello studio. Compilare le informazioni sullo studio e verificare che sia selezionata l'opzione basata su frazioni a più livelli.
Fare doppio clic sul volume per aprire la finestra di dialogo volume. Assegnare un nome alla feature di interesse e selezionare la sonda di conteggio dei punti regione e fare clic su Avanti. Fate doppio clic sulla lunghezza e fornite un nome della feature.
Selezionate sonda sfera e fate clic su Avanti (Next). Nella casella di inizializzazione del caso, per codificare i gruppi prima di iniziare lo studio, impostare il numero totale di sezioni a partire dalla prima sezione contenente l'area di interesse fino all'ultima sezione contenente l'area di interesse e l'intervallo di campionamento della sezione a otto. Fare clic accanto per aprire la finestra di dialogo di inizializzazione del probe che imposta automaticamente l'ingrandimento più basso per la selezione dell'area e la stima del volume e conferma le impostazioni.
Fare clic su anteprima per verificare se l'area di interesse può essere identificata con l'ingrandimento inferiore selezionato. Immettere 50.000 micrometri cubo per punto per la frazione di volume dell'area e fare clic su anteprima e fine. In ingrandimento elevato oggetto, impostate la lunghezza su 63X e fate doppio clic sulla lunghezza per aprire la finestra di dialogo della sfera di lunghezza.
Impostare il diametro di questa sfera su 10 micrometri e fare clic su fatto. Impostate i valori appropriati per l'area del fotogramma, l'altezza del fotogramma, la zona di protezione e la spaziatura del fotogramma. Quindi fare clic su Avanti e seguire le istruzioni fornite dal software.
Per inserire la prima sezione, posizionare la diapositiva sullo stadio del microscopio sotto un obiettivo 5X e fare clic sulla freccia verde per disegnare un limite arbitrario attorno all'NBM per definire la regione di interesse. Fare clic sulla freccia verde e fare per modificare l'obiettivo 63X per ottenere le misurazioni in fibra della frazione corrente. Verrà visualizzata la finestra di dialogo spessore sezione.
Impostate la superficie superiore e inferiore della sezione per misurare lo spessore effettivo della sezione utilizzando la manopola di messa a fuoco manuale dell'asse Z e fate clic su Fatto (Done). Spostate lentamente l'asse Z dall'alto verso il basso nell'altezza del fotogramma della sezione per contrassegnare tutte le fibre intersecante sulla superficie della sonda a sfera virtuale. Quando tutte le fibre sono state contrassegnate, fare clic accanto per passare alla posizione successiva.
Una volta completate tutte le frazioni, fare clic sulla freccia verde. Il software chiederà di inserire la sezione successiva. Portare a fuoco il campione successivo sulla diapositiva utilizzando l'obiettivo 5X e ripetere la misurazione della fibra come appena dimostrato.
Una volta misurate tutte le sezioni, il software genererà un risultato per il caso che mostra il coefficiente dei valori di errore. Se il coefficiente di errore è accettabile, procedere al caso successivo. Se il coefficiente di errore non è accettabile, il software fornirà raccomandazioni per modificare alcuni dei parametri.
Una volta completati tutti i casi, generare risultati per ogni caso e gruppo. In questo esperimento rappresentativo, il gruppo proteico precursore beta amiloide mutante svedese ha dimostrato una lunghezza delle fibre significativamente inferiore e una densità di lunghezza delle fibre rispetto ai loro accoppiamenti di lettiera di tipo selvatico. I risultati hanno anche mostrato che non c'era alcuna differenza significativa nel volume dell'NBM tra i due gruppi analizzati.
Questa tecnica richiede una corretta acquisizione nell'orientamento corretto e un buon metodo di colorazione con il periodo di incubazione. Il protocollo stereologico può essere utilizzato per la stima di qualsiasi profilo lineare come altre fibre neuronali, processi astrociti o persino profili vascolari.
