Ciao, sono Kai Jin dell'Università di Yangzhou. A nome del nostro gruppo di ricerca presenterò un potente strumento dell'embrione di pollo nella ricerca sullo sviluppo. L'embrione di pollo è un modello di sviluppo classico che è stato utilizzato per studiare lo sviluppo e la differenziazione, infatti, le misure estranee del laboratorio negli embrioni di pollo sono uno strumento prezioso per la biologia dello sviluppo, come la trasfezione genica, l'allevamento transgenico e la preparazione transmurale gonadica.
Nel nostro laboratorio, abbiamo stabilito i metodi di iniezione di tipo mu, ma per molti ricercatori, il dettaglio dell'iniezione è poco chiaro e difficile da allineare. Quindi, in questo video, mostreremo i dettagli dell'iniezione vascolare durante la fase iniziale dello sviluppo dell'embrione di pollo in ovo. Non esitate a contattarci se siete interessati a questo.
Qui, mostriamo i dettagli del protocollo. Raccolta e preparazione di uova fecondate. In primo luogo, a differenza dei mammiferi, il pollo ha milioni di follicoli in una singola ovaia, ma solo alcuni di questi follicoli sono abbastanza maturi da ovulare.
Ogni follicolo contiene un ovocita o una cellula germinale. Non appena il follicolo matura e rilascia il suo tuorlo, viene incorporato nell'imbuto della tuba di Falloppio. Quando il follicolo entra nell'addome giugulare dell'ovidotto, lo sperma si lega all'uovo nel corpo della gallina e il calcio nel corpo della gallina forma un guscio che avvolge l'uovo fecondato formando un uovo a guscio morbido nel corpo.
I gusci di calcio si addensano gradualmente fino a produrre l'uovo. Raccogli l'uovo fecondato, accademicamente chiamato uova embrionali e mettile ordinatamente su un rack in un'incubatrice a 37,8 gradi Celsius e 60% di umidità. Gli embrioni vengono incubati in condizioni adeguate.
Dopo due giorni di incubazioni appaiono piccoli punti rossi pulsanti chiamati cuori primordiali. Questo processo è chiamato cherry beating. A circa 2,5 giorni, i vasi sanguigni sono visibili e si sono formati i segmenti del cuore e del corpo.
Preparazione di aghi e plasmidi. Usiamo capillari di vetro come aghi. Prima dell'iniezione preparare capillari di vetro con il diametro esterno di un millimetro e il diametro interno di 0,6 millimetri.
I materiali esogeni di solito sono plasmidi, lentivirus confezionati e cellule germinali primordiali, o PGC. In questo video, usiamo il tripano blu per mostrare la traccia dei materiali iniettati. Windowing. Prima di esporre gli embrioni, dobbiamo sterilizzare gli embrioni per prevenire la contaminazione da germi.
Questo viene fatto pulendo delicatamente la superficie degli embrioni con un batuffolo di cotone alcolico al 75% nel sito di apertura dell'uovo. Dopo la disinfezione, picchiettare delicatamente l'estremità smussata del guscio d'uovo con una pinza e tagliare con cura un foro di 0,5 centimetri per 0,5 centimetri sulla superficie del guscio d'uovo con la pinza per esporre l'embrione. Iniezione intravascolare in-ovo.
Guarda la vista al microscopio, regola la messa a fuoco del microscopio per individuare prima l'embrione e poi trova i vasi sanguigni dell'embrione di pollo pronti per l'iniezione. Puntare l'ago con la sostanza esogena sul vaso sanguigno, notando che l'ago è parallelo al vaso sanguigno iniettato. Inserire delicatamente l'ago nel vaso sanguigno e quindi accendere la pompa dell'aria.
A questo punto, la sostanza estranea entra nell'arteria e con il battito del cuore, circola di nuovo all'embrione attraverso l'arteria e poi alla vena. Esistono due tipi di iniezioni vascolari. Quello è un'iniezione di testa in cui la sostanza estranea viene iniettata da una vena nella testa dell'embrione e ritorna nel cuore.
L'altra è un'iniezione aortica dorsale in cui la sostanza estranea circola all'embrione con il battito del cuore. Con il battito del cuore embrionale e la circolazione del sangue possiamo vedere chiaramente che il materiale estraneo viene ricevuto dai capillari all'estremità dell'arteria, nella vena e quindi ritorna all'embrione dalla vena, indicando che il materiale estraneo iniettato viene effettivamente consegnato a ciascuna parte dell'embrione. Dopo l'iniezione, rimuovere l'uovo dallo stereomicroscopio, tagliare un pezzo di nastro medico lungo tre centimetri con piccole forbici e attaccare il nastro all'apertura.
Raschiare delicatamente il nastro con le forbici per spremere eventuali bolle d'aria, quindi tagliare un altro pezzo di nastro adesivo per sigillare l'apertura in una croce. Dopo aver sigillato l'apertura, gli embrioni iniettati vengono accuratamente riposti nell'incubatrice. Qui mostriamo le immagini rappresentative degli embrioni di pollo dopo l'iniezione.
La prima immagine mostra il risultato dell'iniezione di plasmidi lentivirus. La fluorescenza verde sotto un microscopio a fluorescenza stereoscopica indica il successo dell'espressione del plasmide iniettato negli embrioni. Ciò suggerisce la fattibilità dell'iniezione intravascolare di plasmidi in embrioni di pollo.
La seconda immagine mostra i risultati dell'iniezione di PGC. I PGC sono stati etichettati con RFP. In questa immagine abbiamo potuto vedere i PGC iniettati che sono i punti rossi qui, situati nella gonade dei destinatari.
Ciò indica che i PGC donatori sono stati in grado di entrare e colonizzare efficacemente nella gonna dei riceventi. In conclusione, questo protocollo presenta il processo di iniezione intravascolare in-ovo di materiali esogeni, plasmidi o PGC in embrioni di pollo. Il metodo mostrato qui è facile da seguire e imparare e vale la pena l'applicazione in molti campi.
Questo è tutto ciò che vorrei condividere con voi. Spero che questo approccio faciliti il vostro lavoro come un potente strumento di ricerca nella creazione di embrioni di pollo e nella biologia dello sviluppo. Grazie per aver guardato questo video e buona fortuna con la tua ricerca.
