Lo screening di composti organici più piccoli chiamati frammenti utilizzando la cristallografia a raggi X è un metodo efficiente per identificare le molecole che sono punti di partenza per la scoperta di farmaci o lo sviluppo di composti organici biochimici. Lo screening dei frammenti cristallografici ha rivelato non solo l'identità, ma anche dove e come i frammenti si legano sulla superficie della proteina in esame. Questa tecnica può essere utilizzata su ogni bersaglio proteico biochimicamente o medicalmente rilevante per il quale possono essere coltivati cristalli proteici adatti.
La qualità dei risultati è intimamente legata alla qualità della movimentazione del campione. Crediamo che la seguente dimostrazione visiva aiuterà i ricercatori a condurre esperimenti di alta qualità. A dimostrare la procedura sarà Tatjana Barthel, ricercatrice di dottorato e dottoranda nel mio laboratorio.
Per iniziare, aprire il sacchetto della piastra di vagliatura preri riscaldato a temperatura ambiente, quindi rimuovere il coperchio e il foglio dalla piastra di vagliatura. Decantare la soluzione di ammollo di cinque millilitri nel serbatoio del reagente. Quindi riempire ciascuno dei 96 serbatoi della piastra con 40 microlitri di soluzione di ammollo utilizzando una pipetta a 12 canali.
Posizionare il telaio di facile accesso sopra la piastra di vagliatura e fissarlo con i morsetti inclusi facendoli scorrere sul lato sinistro e destro del dispositivo. Posizionare la piastra di vagliatura e il telaio di facile accesso al microscopio e far scorrere il primo pozzo spostando la rispettiva piastrella di vetro acrilico del telaio. Aggiungere 0,4 microlitri di soluzione di ammollo dal serbatoio al frammento contenente bene utilizzando una punta di pipetta fresca.
Assicurarsi che la goccia copra il frammento essiccato. Posizionare la piastra di cristallizzazione che contiene i cristalli più grandi al secondo microscopio e aprire il foglio di tenuta in uno dei pozzi. Utilizzando un anello di dimensioni appropriato, trasferire un cristallo sul pozzo della piastra di vagliatura al primo microscopio.
Lavare l'anello nella piastra spot di vetro preparata, quindi asciugarlo toccandolo delicatamente al tessuto. Fallo dopo ogni trasferimento per evitare la contaminazione incrociata. Utilizzare il microscopio per assicurarsi che il cristallo sia stato posizionato correttamente.
Ripetere la procedura per il secondo cristallo. Passare al pozzo successivo e ripetere la procedura per tutti i pozzi rimanenti. Dopo che i cristalli sono stati trasferiti in tutti i 96 pozzi della piastra di vagliatura, rimuovere la piastra di vagliatura insieme al telaio di facile accesso dal microscopio e posizionarla sulla panca o sul tavolo.
Quindi rimuovere il telaio di facile accesso dalla piastra di vagliatura, sigillare la piastra di vagliatura con un foglio di tenuta e posizionarla nell'incubatore di cristallizzazione o nell'armadio per incubare per il tempo di ammollo precedentemente ottimizzato. Due ore di incubazione sono sufficienti, ma durante la notte possono essere più convenienti. Preparare la schiuma Unipuck Dewar con tre coperchi Unipuck e metà riempirla con azoto liquido, mantenendola a terra.
Spostare il Dewar mezzo pieno sulla panchina e riempirlo completamente fino al limite. Tenerlo riempito sul bordo superiore durante l'intero esperimento e sostituire frequentemente l'azoto liquido. Recuperare la piastra di vagliatura dall'incubatore e rimuovere il foglio.
Posizionare il telaio di facile accesso in alto. Aprire il primo pozzo. Raccogli un cristallo dalla goccia e lampeggialo raffreddarlo in azoto liquido immergendoti con un rapido movimento verticale.
Inserire il campione nella posizione corretta del disco e prendere appunti pertinenti nel foglio di tracciamento del campione. Ripetere la procedura per il secondo cristallo. Vai al pozzo successivo e ripeti il posizionamento di altri cristalli fino a quando tutti e tre i dischi sono pieni.
Pre-raffreddare le basi Unipuck in azoto liquido e aggiungerle sopra i coperchi. Conservare le Unipucks nel rack di stoccaggio in un dewar di trasporto o in un deposito Dewar. Tenerli in azoto liquido a temperature criogeniche fino alla misurazione.
Ripetere la stessa procedura di raccolta e conservazione dei cristalli in Unipucks per i campioni rimanenti nella piastra di vagliatura. La variabilità delle morfologie cristalline dopo aver eseguito l'ammollo del frammento e la raccolta del cristallo è mostrata qui. Sono stati inclusi anche cristalli che sembrano un po 'deteriorati, in quanto si traducono ancora in dati utili.
I dati sono stati raccolti alle linee di fascio 14.1 e 14.2 al sincrotrone BESSY II. Per ogni campione è stata eseguita la raccolta dei dati di diffrazione. I dati sono stati analizzati utilizzando FragMAXapp, concentrandosi sulla combinazione di XDSAPP per l'elaborazione, fspipeline per il perfezionamento della struttura e PenDA per la ricerca di hit.
Ciò ha portato a 15 colpi sul complesso proteico AR utilizzando una condizione di ammollo senza DMSO. In una precedente campagna della schermata di ingresso F2X contro lo stesso bersaglio, incluso DMSO nelle condizioni di ammollo, sono stati trovati 20 colpi. Ciò significa che il 75% dei riscontri può essere identificato se DMSO viene omesso.
Per il successo dell'esperimento, è fondamentale che i cristalli siano maneggiati correttamente e con attenzione durante ogni fase della procedura. Lo screening dei frammenti cristallografici è maturato con una tecnica ampiamente utilizzata, che viene spesso applicata nel mondo accademico e nell'industria farmaceutica.
