Questo protocollo può aiutare i ricercatori a separare facilmente le retine dei topi e osservare i cambiamenti dinamici nella vascolarizzazione retinica del modello murino OIR. I principali vantaggi di questo metodo sono la conservazione dell'integrità delle retine separate e la possibilità che ogni topo funga da controllo proprio, il che rende i risultati più comparabili. I ricercatori che provano questo metodo per la prima volta potrebbero avere difficoltà durante l'acquisizione delle cinque immagini di orientamento perché è un po 'difficile posizionare i cuccioli nella posizione corretta.
Per raccogliere il tessuto per l'intero montaggio della retina, utilizzare forbici curve per scollegare i bulbi oculari dal tessuto orbitale di un cucciolo di C57-Black / 6 eutanasia. Quindi, inserire una pinza curva nella parte posteriore del bulbo oculare, bloccando il nervo ottico e sollevando rapidamente l'occhio dall'orbita. Posizionare i bulbi oculari in PBS pre-raffreddato per rimuovere eventuali peli e sangue dalla superficie.
Quando tutti i bulbi oculari sono stati raccolti, trasferire i bulbi oculari puliti in un tubo di microcentrifuga da due millilitri contenente il 4% di paraformaldeide e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente e da 12 a 15 giri al minuto. Alla fine dell'incubazione, aggiungere una goccia di PBS al centro di un piatto di coltura al microscopio da dissezione e posizionare un bulbo oculare nella goccia. Tenendo il bulbo oculare con un paio di pinze, utilizzare un ago da siringa da un millilitro per perforare accuratamente la cornea al limbus corneale.
Inserire la punta di un paio di forbici nella puntura e tagliare la cornea lungo il limbus corneale, facendo attenzione a non tagliare la retina. Utilizzare una pinza per rimuovere l'iride e la lente e posizionare la concia oculare rimanente in paraformaldeide al 4% per un'incubazione di 45 minuti a temperatura ambiente sullo shaker. Alla fine dell'incubazione, posizionare la coppa oculare fissa in una goccia fresca di PBS al centro di un nuovo piatto di coltura.
Tenendo la concia oculare con un paio di pinze, utilizzare un secondo paio di pinze per separare delicatamente gli strati di retina e sclera. Posizionare la punta delle forbici tra gli strati di retina e sclera e tagliare la sclera verso il nervo ottico. Staccare la sclera dalla retina per ottenere la coppa retinica.
Utilizzando una pinza, rilasciare la connessione tra i vasi ialoidi radiali e la retina periferica. Utilizzare una pipetta da due millilitri con la punta tagliata per trasferire la coppa retinica in un pozzetto di una piastra da 48 pozzetti per tre lavaggi di cinque minuti in PBS a temperatura ambiente sullo shaker. Dopo l'ultimo lavaggio, incubare la tazza in 1% Triton X-100 e 5% siero d'asino normale in PBS durante la notte a quattro gradi Celsius.
Per etichettare la vascolarizzazione retinica con isolectina B4, incubare la retina in un pozzetto di una piastra da 48 pozzetti in 400 microlitri 0,1% siero normale d'asina integrato con isolectina B4-594 durante la notte a 4 gradi Celsius su uno shaker. Se necessario, è possibile aggiungere contemporaneamente un altro anticorpo primario. Il giorno seguente, lavare la retina con tre lavaggi di 20 minuti in 0,1% PBST sullo shaker.
Dopo l'ultimo lavaggio, incubare la retina con un anticorpo secondario appropriato ad alta affinità per un'ora a temperatura ambiente prima di marcare il campione con DAPI per 20-25 minuti. Alla fine dell'incubazione, lavare la retina con tre lavaggi di 30 minuti in 0,1% PBST a temperatura ambiente con agitazione. Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire la coppa retinica su un vetrino pulito con l'apertura rivolta verso l'alto e utilizzare il microscopio per tagliare la retina radialmente nelle posizioni a tre, sei, nove e 12 ore dalla periferia verso il centro, fino a uno a 1,5 millimetri dalla testa del nervo ottico.
Risciacquare la retina tre volte con alcune gocce di PBS per lavaggio prima di utilizzare carta posata all'aria per asciugare e appiattire la retina. Aggiungere una goccia di supporto di montaggio al centro del coprislip fino a quando il diametro della goccia copre metà del coprifoglio. Quindi posizionare rapidamente il lato medio di montaggio del coprislip verso il basso sulla retina diffusa.
Una volta che tutti i supporti piatti retinici sono stati preparati, i campioni possono essere visualizzati mediante microscopia a fluorescenza confocale. Per l'imaging in vivo, aggiungere 20 microlitri di collirio midriatico per ottenere una dilatazione della pupilla di lunga durata. Dopo cinque minuti, posizionare i cuccioli in una posizione stabile su una piccola piastra elettrica davanti al dispositivo di imaging.
Per mantenere l'umidità nelle cornee, aggiungere regolarmente lacrime artificiali durante la procedura di imaging. Quindi, fare clic su Infrared Fundus Imaging sul dispositivo per regolare la testa del nervo ottico al centro dello schermo. Iniettare per via intraperitoneale 150 microlitri di soluzione di sale sodico di fluoresceina allo 0,5% e fare immediatamente clic sui pulsanti FA e Iniezione sul pannello a sfioramento del dispositivo di imaging per avviare il timer.
Dopo tre minuti, quando la circolazione sanguigna della retina è entrata nella fase venosa, acquisire la prima immagine della retina centrale. Spostare la lente del dispositivo di imaging orizzontalmente sul lato nasale dell'occhio fino a quando la testa del nervo ottico si trova nel punto medio di un lato dell'area di acquisizione dell'immagine e scattare la seconda immagine. Continua a muovere l'obiettivo e acquisisci immagini della retina temporale, superiore e inferiore allo stesso modo.
Per elaborare le immagini retiniche in un programma di elaborazione delle immagini appropriato, aprire il menu File e fare clic su Nuovo per creare una nuova area di disegno con uno sfondo nero. Apri l'immagine della retina centrale. Quindi fare clic su File per aggiungere una seconda immagine.
Regola l'opacità della seconda immagine al 60% e sposta e ridimensiona l'immagine fino a quando le due immagini non si sovrappongono. Fate clic su Passa tra le modalità Trasformazione libera (Free Transform) e alterazione (Warp Mode) e, se necessario, apportate lievi regolazioni ai recipienti. Quindi impostate nuovamente l'opacità della seconda immagine su 100%Selezionare entrambe le immagini e fare clic su Livelli di fusione automatica.
Selezionare Panorama come metodo di fusione, quindi selezionare le caselle Toni e colori senza soluzione di continuità e Aree trasparenti di riempimento sensibili al contenuto. Fare clic su OK per completare l'unione delle prime due immagini. Quindi, aggiungi la terza immagine e unisci questa immagine alle prime due immagini come dimostrato fino a quando tutte e cinque le immagini di una singola retina sono state cucite.
Quando tutte le immagini dell'analisi sono state elaborate, utilizzare lo strumento di ritaglio per ritagliare le immagini FFA a una dimensione uniforme per facilitare l'osservazione dei cambiamenti nelle dinamiche vascolarizzanti retiniche in diversi punti temporali dello sviluppo. Dopo cinque giorni di esposizione all'iperossia, le retine centrali dei cuccioli postnatali del giorno 12 mostrano un'ampia area di non perfusione. Dopo il trasferimento a cinque giorni di condizioni ipossiche, le retine gradualmente neovascolarizzano, mostrando un aumento del segnale di fluorescenza più forte di quello osservato nei vasi normali circostanti.
Dopo il giorno 17 postnatale, la neovascolarizzazione patologica regredisce rapidamente e la retina mostra un aspetto completamente normale entro il giorno 25 postnatale. Una buona ripetibilità e stabilità del modello di retinopatia indotta dall'ossigeno può essere ottenuta controllando le dimensioni della cucciolata e l'aumento di peso postnatale dei cuccioli. Come osservato, la vaso-obliterazione raggiunge tipicamente il picco al giorno postnatale 12 e scompare al giorno postnatale 25, mentre la neovascolarizzazione raggiunge il picco al giorno postnatale 17 e regredisce entro il giorno postnatale 25.
Nel giorno postnatale da 15 a 25 topi con retinopatia indotta da ossigeno, il diametro dei vasi sanguigni retinici aumenta e diventa altamente tortuoso rispetto a quello osservato per le retine dei topi normali. Le pinze della mano sinistra svolgono principalmente un ruolo di supporto. Fare attenzione a non spremere il bulbo oculare, che può deformarlo o romperlo.
