Questo nuovo modello di organoide derivato dai denti umani fornisce il primo potente strumento per decifrare la biologia delle cellule staminali dentali umane con prospettive verso le applicazioni rigenerative dei denti. Allo stato attuale, questo modello di organoide dentale è l'unico strumento disponibile per far crescere ed espandere in modo affidabile e robusto le cellule staminali epiteliali dei denti umani. Questo protocollo organoide può essere applicato per stabilire modelli di ricerca, non solo da denti sani, ma anche malati come tumori dentali e impatto batterico.
L'esplorazione di tali modelli di malattia può scoprire nuovi bersagli terapeutici. Questo modello organoide è altamente strumentale nel decifrare il processo di formazione dello smalto nel dente umano e può consentire la costruzione di parti dei denti come lo smalto per scopi generativi. A dimostrare la procedura sarà Lara Hemeryck, dottoranda del mio gruppo di ricerca.
Per iniziare, raccogliere i terzi molari con follicoli dentali associati nel mezzo di raccolta posto sul ghiaccio e trasferire il contenuto dei tubi in una capsula di Petri. Tenere il dente con una pinzetta e isolare accuratamente i follicoli dentali usando una lama chirurgica. Lavare il sangue rimanente dai follicoli dentali posizionando brevemente i tessuti del follicolo dentale nel primo pozzetto di etanolo al 70% per 20 secondi, quindi trasferirlo alla successiva piastra di etanolo di morte per 20 secondi e ulteriormente al terzo pozzo di etanolo.
Continuare a risciacquarlo in pozzetti salini tamponati con fosfato tre volte seguito dal risciacquo dei follicoli dentali nei tre restanti pozzetti medi di raccolta dei follicoli dentali per un massimo di 20 minuti in totale. Trasferire i follicoli dentali risciacquati in una nuova capsula di Petri. Tagliare un piccolo pezzo di uno dei follicoli dentali per una fissazione di paraformaldeide e conservarlo in un tubo di microcentrifuga contenente 500 microlitri di mezzo di raccolta per un massimo di sei ore.
Tritare il resto dei follicoli dentali in piccoli pezzi e trasferirli in un tubo da 15 millilitri contenente quattro millilitri di mezzo di dissociazione prebellico, quindi incubare il tubo a 37 gradi Celsius per due ore a bagnomaria. Ogni 15 minuti, pipettare il mezzo di dissociazione dei follicoli dentali e mescolare su e giù usando una pipetta di vetro per accelerare la disintegrazione del tessuto. Quando i pezzi di follicoli dentali non vengono più osservati, procedere con la dissociazione utilizzando una pipetta Pasteur ristretta e lucidata a fuoco.
Nel frattempo, preparare 10 millilitri di mezzo A contenenti 100 microlitri di DNasi e aggiungere cinque millilitri di questo mezzo a ciascun tubo con follicoli dentali dissociati. Incubare per un minuto a temperatura ambiente. Risciacquare il filtro con un millilitro di mezzo A.Combinare i diversi tubi di follicoli dentali dissociati da un paziente in questa fase e centrifugare la sospensione cellulare filtrata a 200 volte g per 10 minuti a 4 gradi Celsius.
Rimuovere il surnatante. Sospendere il pellet in un millilitro di mezzo definito privo di siero e trasferire la sospensione cellulare in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri. Calcola la concentrazione cellulare utilizzando un contatore cellulare automatizzato e calcola il numero di pozzi che possono essere seminati.
La miscela finale è composta da sospensione cellulare e matrice di membrana basale con un rapporto compreso tra 30 e 70. Rimuovere la quantità appropriata di surnatante e risospesirla lentamente per ottenere un rapporto da 70 a 30 tra matrice di membrana basale ghiacciata e sospensione cellulare per la placcatura. Una volta risospeso nella matrice della membrana basale, mantenere il tubo di microcentrifuga sul ghiaccio per evitare la solidificazione della matrice della membrana basale.
Pipettare i 20 microlitri di goccioline a matrice di membrana basale al centro della piastra di coltura preriscaldata a 48 pozzetti. Capovolgere la piastra e posizionarla per solidificare in un incubatore di anidride carbonica all'1,9% a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Aggiungere l'inibitore della chinasi rho-associato e l'amfotericina B al mezzo organoide del dente e pre-riscaldamento del mezzo in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius.
Prendi la piastra a 48 pozzetti dall'incubatrice. Posizionalo in posizione verticale e aggiungi 250 microlitri del mezzo preriscaldato preparato a ciascun pozzetto con una goccia a matrice di membrana basale contenente le cellule e restituisci la piastra all'incubatore di anidride carbonica. Per aggiornare il mezzo, inclinare la piastra con un angolo di 45 gradi.
Rimuovere delicatamente il mezzo precedente, evitando di toccare la goccia della matrice della membrana basale e aggiungere 250 microlitri di nuovo mezzo organoide del dente preriscaldato ogni due o tre giorni. Per effettuare il passaggio degli organoidi, rimuovere il mezzo dai pozzetti con gli organoidi e raggruppare fino a quattro pozzi confluenti. Per raccogliere gli organoidi, aggiungere 400 microlitri di mezzo definito privo di siero ghiacciato per pozzetto direttamente sulla goccia della matrice di membrana e pipettare ripetutamente il mezzo su e giù fino a quando l'intera goccia non viene rimossa.
Se i pozzetti sono raggruppati, trasferire i 400 microlitri dal primo pozzo al successivo per rimuovere le goccioline contenenti organoidi. Trasferire l'assemblaggio organoide spostato in un tubo microcentrifuga da 1,5 microlitri e ripetere l'aggiunta di un mezzo definito privo di siero fino a quando tutte le strutture organoidiche vengono raccolte dai pozzetti. Centrifuga a 200 volte g per cinque minuti a 4 gradi Celsius.
Rimuovere il surnatante dal tubo della centrifuga e risospese il pellet in un'aliquota preriscaldata di TrypLE Express. Aggiungere 400 microlitri di mezzo definito privo di siero ghiacciato per inattivare l'enzima e centrifugarlo a 200 volte g per cinque minuti a 4 gradi Celsius. Rimuovere il surnatante.
Pre-rivestire una punta con un mezzo definito privo di siero ghiacciato e ri-sospendere il pellet organoide in condizioni sterili. Sospendere nuovamente il pellet in 200 microlitri di siero ghiacciato libero da siero definito per il metodo a basso passaggio. Spingere la punta della pipetta completamente svuotata contro il fondo del tubo della micro centrifuga per ridurne il diametro.
Pipettare su e giù per cinque minuti per interrompere meccanicamente gli organoidi. Per il metodo di passaggio superiore, risospesciare il pellet in 700 microlitri di mezzo definito senza siero ghiacciato con una punta P1000. Aggiungi una punta P200 a questa punta P1000 e pre-rivestita con un mezzo definito privo di siero ghiacciato.
Prevenire la formazione di bolle d'aria regolando l'impostazione del volume della pipetta. Aspirare almeno il 90% del volume medio con organoidi e pipetta su e giù per cinque minuti per interrompere meccanicamente gli organoidi. Gli organoidi si sviluppano tipicamente due settimane dopo la semina delle cellule del follicolo dentale.
Gli organoidi sono espandibili a lungo termine fino a 11 passaggi. La semina di circa 20.000 cellule per goccioline di matrice di membrana basale produce una densità ottimale di organoidi, mentre la semina di un numero più elevato di cellule porta a una crescita organoide non ottimale con organoidi simili a densità troppo elevata a causa dello spazio insufficiente per crescere. Gli organoidi sviluppati mostrano un aspetto denso e contengono cellule che mostrano un alto rapporto nucleocitoplasmatico.
Inoltre, gli organoidi esprimono il marcatore ERM citocheratina 14 confermando la loro origine epiteliale e altri marcatori ERM proposti, come P63, CD44 e integrina alfa-6. Gli organoidi esprimono SOX2, un marcatore DESC ben noto nei topi. È interessante notare che il componente principale della matrice dello smalto, l'amelogenina, espresso anche negli organoidi.
Gli organoidi mantengono il loro fenotipo di staminalità ERMM durante il passaging come dimostrato dall'espressione stabile dei marcatori. Per una crescita ottimale degli organoidi a lungo termine, è essenziale utilizzare i metodi di passaggio raccomandati, ovvero i metodi di passaggio basso o i metodi di passaggio superiore. Una volta formati, gli organoidi possono essere utilizzati per esaminare ulteriormente il processo di amelogenesi e la deposizione della matrice dello smalto attualmente non raggiunta nella ricerca odontoiatrica.
Questa tecnica consente l'esplorazione della biologia delle cellule staminali epiteliali dentali, il processo di formazione dello smalto e l'interazione con il mesenchima del dente, un'interazione essenziale per la corretta formazione dei denti.
