L'obiettivo generale dell'esperimento era quello di identificare frammenti di DNA affiliati alle proteine in tutto il genoma, che riflettevano lo stato della cromatina. Per raggiungere questo obiettivo, sono state eseguite tre operazioni speciali. Prima di tutto, i nuclei intatti delle cellule vegetali sono stati isolati.
In secondo luogo, le modifiche alla cromatina sono state riconosciute da un anticorpo specifico in situ. In terzo luogo, l'anticorpo che lega una proteina di fusione A-transposasi, la trasposasi Tn5, scinde la cromatina in situ sotto l'attivazione degli ioni magnesio. I frammenti di DNA e i siti di legame per la modifica della cromatina sono stati quindi integrati con adattatori e preparati per la preparazione del DNA.
Arricchimento della reazione a catena della polimerasi potenziato sequenziamento della generazione. La regolazione dell'epigenomica a livello cromatico, comprese le modificazioni del DNA e degli istoni, i comportamenti dei fattori di trascrizione e gli RNA non codificanti con le loro proteine reclutate, portano al controllo temporale e spaziale dell'espressione genica. La tecnologia CUT&Tag sviluppata da Henikoff Lab è un metodo di tethering enzimatico per la profilazione dell'epigenomica della cromatina ad alta efficienza.
Qui impieghiamo le foglie di cotone come materiali sperimentali e per eseguire il profilo della cromatina utilizzando l'anticorpo dell'istone H3 Lisina-4 Trimetilazione come esempio. Forniamo un protocollo raffinato con video per le prestazioni CUT&Tag negli impianti. Per ogni preparazione del campione utilizzando CUT&Tag, è stato raccolto un grammo di tessuto fogliare di cotone.
La foglia è stata macinata in una polvere fine con azoto liquido e trasferita in un tubo di falco da 50 ml contenente 25 ml di tampone di isolamento nucleare refrigerato A.La soluzione tampone è stata miscelata delicatamente e il tubo è stato incubato sul ghiaccio per cinque minuti con un leggero scuotimento per disperdere il materiale in modo uniforme. È stato quindi filato a 500 forza centrifuga relativa o rcf, a 4 gradi Celsius, per cinque minuti, per formare il pellet cellulare. Il surnatante è stato travasato e il pellet è stato risospeso con 20 ml di tampone di isolamento nucleare refrigerato B, integrato con lo 0,5% di tritone.
Il tubo è stato invertito delicatamente per risospese completamente il pellet. Il lisato cellulare risultante è stato quindi filtrato con una combinazione di due setacci, un setaccio a 500 maglie è stato utilizzato sulla parte superiore per rimuovere i detriti di tessuto più grandi. E un setaccio a 1000 maglie è stato utilizzato sul fondo per raccogliere i nuclei.
La scelta della dimensione delle maglie appropriata dei setacci dipende dalla dimensione dei nuclei delle piante. La carta da filtro sterile è stata utilizzata sul retro del setaccio per assorbire parte del lisato e dei detriti delle piccole cellule. Il lisato contenente i nuclei è stato trasferito in un tubo di centrifuga fresco da 1,5 millilitri e filato a 300 rcf per quattro minuti, a 4 gradi Celsius celsius celsius per raccogliere i nuclei.
Dopo la centrifugazione, è stata utilizzata una punta di pipetta per rimuovere il più possibile il surnatante. Una quantità di 800 microlitri, è stato aggiunto un tampone di lavaggio nucleare. E il tubo è stato invertito delicatamente per risospese i nuclei.
Il tubo è stato girato di nuovo a 300 rcf, per quattro minuti a 4 gradi Celsius. Dopo un totale di tre lavaggi, i nuclei risultanti sono stati combinati in un tubo di centrifuga fresco da 1,5 millilitri e filati a 300 rcf, per quattro minuti a 4 gradi Celsius. Una punta della pipetta è stata utilizzata per rimuovere il più possibile il buffer rimanente.
Il passo successivo è stata l'incubazione dell'anticorpo. Un'aliquota di 50 microlitri di nuclei è stata risospesa in 1 millilitro di tampone anticorpale integrato con EDTA, BSA, cocktail inibitore della proteasi nella digitonina. Un'aliquota di 150 microlitri della sospensione dei nuclei è stata posta in un tubo fresco da 1,5 millilitri per una reazione, due microlitri di anticorpi sono stati aggiunti a ciascun tubo.
In questo test, due repliche biologiche per l'anticorpo anti-istone-H3-Lisina-4-Trimetilazione e i gruppi di controllo immunoglobuline G negativi sono stati istituiti dopo l'aggiunta dell'anticorpo. La soluzione è stata miscelata delicatamente e i tubi sono stati lasciati su uno shaker orizzontale per l'ibridazione durante la notte a quattro gradi Celsius a 12 giri / min. La mattina dopo, i tubi sono stati estratti e i nuclei sono stati lavati usando 800 microlitri di tampone di lavaggio immunopercitante.
Il tubo è stato invertito delicatamente per la miscelazione ed è stato lasciato sullo shaker orizzontale per cinque minuti a temperatura ambiente a 12 giri / min. Dopo il lavaggio, il tubo è stato filato a 300 rcf per quattro minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, il surnatante è stato rimosso utilizzando una punta di pipetta.
Questo è stato ripetuto per un totale di tre lavaggi. Dopo il terzo lavaggio, il tubo è stato filato di un 300 rcf per due minuti a quattro gradi Celsius e una punta della pipetta è stata utilizzata per rimuovere il buffer rimanente il più possibile. Preparare la miscela di trasposasi Tn5 per l'incubazione.
Un microlitro di transposasi è stato aggiunto a ciascuno dei 150 microlitri del tampone di incubazione della transposasi. Si consiglia di preparare prima la miscela di soluzione di transposasi in base al numero di reazioni. E poi aggiungendo un'aliquota di 150 microlitri a ciascun tubo.
La soluzione è stata miscelata delicatamente e lasciata su uno shaker orizzontale a temperatura ambiente a 12 giri / min per due ore. I tubi sono stati miscelati delicatamente ogni 10-15 minuti. Dopo l'incubazione, i nuclei sono stati lavati tre volte utilizzando 800 microlitri di tampone di lavaggio immunopercitante a temperatura ambiente per rimuovere la trasposasi Tn5 non legata.
Dopo il terzo lavaggio, il tubo è stato filato a 300 rcf per due minuti a quattro gradi Celsius e una punta della pipetta è stata utilizzata per rimuovere il buffer rimanente. Per la fase di tagmentazione, 300 microlitri di tampone di tagmentazione sono stati aggiunti al tubo di reazione. La soluzione è stata miscelata bene e incubata a 37 gradi Celsius per un'ora.
Dopo l'incubazione sono stati aggiunti 10 microlitri di 0,5 moli per litro di EDTA a 30 microlitri del 10% di SDS per determinare la reazione. Successivamente sono stati aggiunti 300 microlitri di tampone di estrazione del DNA. È stata eseguita un'estrazione irregolare del DNA.
I frammenti di DNA sono stati disciolti in 25 microlitri di acqua sterile. 24 microlitri sono stati utilizzati per l'amplificazione PCR nella costruzione di librerie NGS. Questa figura mostra la colorazione dei nuclei intatti con DAPI in immagine, al microscopio ottenere una quantità adeguata di nuclei intatti e relativamente puliti è il passo critico per CUT&Tag.
Dopo la PCR, sono stati trasferiti due microlitri e la dimensione del DNA è stata controllata su gel di agarosio all'1,5%. Questa figura mostra che si confrontano con il controllo negativo del gene delle immunoglobuline. La maggior parte dei frammenti di DNA dal campione di trimetilazione di istone H3 lisina 4 dovrebbe variare da 280 a 500 coppie di basi.
I frammenti di DNA possono essere purificati e quindi profilati mediante sequenziamento ad alto rendimento. Questa figura mostra il sequenziamento della generazione dei risultati per l'anticorpo anti-istone H3 Lisina 4 Trimetilazione rispetto ai gruppi di controllo immunoglobuline G negativi. Questa tecnologia genera le librerie di DNA ad alta risoluzione e sfondo eccezionalmente basso utilizzando un piccolo numero di cellule con una procedura semplificata rispetto a ChIP-seq.
CUT&Tag è un metodo nuovo e ancora in corso.
