Il nostro protocollo scopre marcatori epigenetici per lo sviluppo di piante di sorgo e la resistenza alla siccità. Tale comprensione molecolare aiuterà a sviluppare soluzioni migliori per adattare le colture ai climi estremi in futuro. Questo protocollo genera istoni ad alta purezza dal tessuto fogliare di sorgo adatto per la profilazione non mirata di modifiche post-tras tras trasutzionali mediante spettrometria di massa.
A dimostrare la procedura saranno Shadan Abdali e Tanya Winkler, research associate post-bachelor di EMSL. Per iniziare, macinare alcune foglie di sorgo con azoto liquido e conservarle in un tubo di centrifuga da 50 millilitri a meno 80 gradi Celsius. Utilizzare circa quattro grammi della polvere fogliare per l'analisi istono di ciascun campione.
Preparare i buffer di estrazione 1, 2A e 2B come descritto nel manoscritto testuale e aggiungere una compressa di inibitore della proteasi al tampone di estrazione uno per effettuare una concentrazione finale di 0,2X. Quindi aggiungere 20 millilitri del tampone di estrazione preparato uno alla polvere di foglie macinate e mescolare delicatamente o vortice per 10 minuti. Utilizzando la rete 100, sciacquare il materiale filtrato due volte con due millilitri di tampone di estrazione uno ogni volta.
Successivamente, centrifugare il filtrato a 3.000 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius in un rotore a secchio oscillante per pellettizzare i detriti cellulari e i grandi organelli subcellulari. Contemporaneamente, preparare il buffer di estrazione 2A aggiungendo l'inibitore della proteasi a una concentrazione finale di 0,4X. Scartare il supernatante senza disturbare il pellet.
Quindi rimostrare il pellet in cinque millilitri del tampone di estrazione preparato 2A. Incubarlo sul ghiaccio per 10 minuti con miscelazione delicata. Centrifugare la soluzione a 2.100 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius in un rotore a secchio oscillante per pellettare detriti e nuclei.
Decantare attentamente il supernatante senza disturbare il pellet. Preparare il buffer di estrazione 2B aggiungendo gli inibitori della proteasi a una concentrazione finale di 1X. Aggiungere cinque millilitri di questo tampone preparato al pellet ottenuto dopo la centrifugazione.
Centrifuga a 2.100 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius nel rotore della benna oscillante per pellet detriti e nuclei. Contemporaneamente, preparare il tampone di lysis dei nuclei aggiungendo una compressa inibitore della proteasi. Decantare con cura il supernatante senza disturbare il pellet e rimescolare il pellet in 250 microlitri del tampone dilisi.
Vortice la soluzione per 15 secondi alla massima velocità per omogeneizzarla e rimorsi il materiale. Quindi sonicalo per cinque minuti a quattro gradi Celsius e conservalo a meno 80 gradi Celsius. Scongelare il campione di nuclei congelati e aggiungere 750 microlitri di tampone di guanidina al 5%.
Quindi sonicare per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il campione su un tubo a due millilitri e ruotarlo a 10.000 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Contemporaneamente, preparare una colonna di cromatografia a scambio ionico risciacquarla con due millilitri di acetonitrile e quattro millilitri di acqua per ridurre al minimo la contaminazione sulla superficie.
Caricare circa 200-300 microlitri di resina debole di scambio di cationi sulla colonna cromatografica e lasciare depositare la resina. Lavare la resina quattro volte con tampone di guanidina e posizionare il tubo e la colonna sul ghiaccio. Mettere la colonna su un tubo di raccolta di due millilitri e caricare lentamente il supernatante dal campione preparato sul letto di resina senza interrompere la resina.
Mentre la soluzione scorre, caricare l'eluente verso la parte superiore della colonna da sei a otto volte per consentire il massimo legame con la resina. Quindi caricare due millilitri di tampone di guanidina al 5% per lavare le proteine non istonici dalla colonna. Eluire le proteine istonici con un millilitro di tampone di guanidina al 5% e raccogliere l'eluente.
Pulire un filtro di spin cutoff da tre kilodalton con 500 microlitri di solvente di lavaggio, quindi disalt l'eluente rimanente utilizzando il filtro di rotazione pre-pulito. Le principali proteine istono sono state osservate in regioni specifiche della mappa caratteristica LC-MS che indicano il successo dell'esperimento. Questa mappa rappresentativa mostra istoni intatti a figura intera in scatole tratteggiate.
La mappa delle caratteristiche LC-MS dei proteoformi H2B e 16 kilodalton H2A mostra che entrambi hanno più omologhi con sequenze simili come notato dai numeri di sessione del prodotto unici. Si può vedere un altro gruppo di istoni H2A senza le code estese. L'acetilazione N-terminale, le acetilazioni di lisina aggiuntive e le ossidazioni di meionina nelle proteine istono H4 possono essere osservate esaminando le differenze di massa nella mappa caratteristica LC-MS mostrata qui.
Sono state identificate due sequenze proteiche per le proteine istono H3, H3.3 e H3.2. La frammentazione della dissociazione da trasferimento elettronico è stata utilizzata per generare lo spettro di frammentazione del proteoforma H3.2 identificato. Gli ioni precursori e gli spettri Ms1 precedenti e successivi sono mostrati qui con i loro picchi isotopici abbinati evidenziati in viola.
Le modifiche post-traslazione possono essere localizzate utilizzando la mappa di copertura della sequenza. Confrontando l'abbondanza relativa delle proteoforme, sono stati scoperti cambiamenti di proteoforme istono troncate specifiche delle condizioni del campione. Il troncamento C-terminale dell'H4 è stato osservato solo nelle settimane tre e nove per alcuni campioni.
Per H3.2, le proteoforme troncate N-terminale erano generalmente più abbondanti nella settimana 10. Al contrario, il terminale C troncato H3.2 è stato visto nei punti di tempo precedenti. Le proteoforme troncate H4 C-terminale erano significativamente più abbondanti in BTx642 che in RTx430.
Quando si tenta questo protocollo, prestare molta attenzione ai colori del supernatante e del pellet. Il cambiamento di colore aiuta a identificare potenziali problemi nella macinazione o lisi del cloroplasto. Speriamo che questo solido protocollo per l'isolamento istono dalle foglie di sorgo consenta la ricerca epigenetica per altre piante simili.
