Gli autori ringraziano Vanessa Meldener-Harrell per la lettura critica del manoscritto.

L'uso dei topi come fonte di sangue per l'alimentazione delle chiazza di sabbia è stato effettuato in stretta conformità con le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio degli Istituti nazionali di salute (NIH). Il protocollo è stato approvato dal Comitato per la cura e l'uso degli animali del NIAID, NIH (numero di protocollo LPD 68E). Gli invertebrati non sono coperti dalle linee guida NIH.
1. Preparazione dell'ago(figura 1)
<ol><li>Tirare aghi e smussare come descritto in Meuti e Harrell19. In breve, tirare gli aghi su un estrattore di micropipette di vetro a doppio stadio, utilizzando capillari di vetro borosilicato.</li>
	<li>Affilare gli aghi smussando bagnati sul smussatore di micropipette, utilizzando una pietra extra fine.</li>
</ol>2. Raccolta e micromanipolazione degli embrioni(figura 2)
<ol><li>Cinque giorni prima del giorno dell'iniezione, il sangue alimenta le femmine di mosca e la mosca come viene eseguita regolarmente per il mantenimento della colonia. Per i dettagli sulle procedure di allevamento delle colonie di mosche di sabbia e sul materiale richiesto, fare riferimento a Avvocato etal.<ol>
<li>Un giorno dopo l'alimentazione del sangue, cattura le femmine nutrite con sangue da gruppi di 100-150 in vasi di gesso con una porta laterale. Mantieni le femmine nutrendole con una soluzione di zucchero (30% di saccarosio - abbastanza volume per immergere un piccolo batuffolo di cotone) che è usuale per il mantenimento della colonia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Al giorno 2-3 dopo l'alimentazione del sangue, NON inumidire i vasi di gesso. Mantenere le femmine su un substrato asciutto impedirà la deposizione prematura delle uova, poiché le femmine preferiscono deporre le uova in un ambiente umido.</li>
	<li>Il giorno 5 dopo l'alimentazione del sangue, eseguire la raccolta dell'embrione, la micromanipolazione e la microiniezione. Introdurre una carta filtrante umida nella camera di deposizione delle uova. Gli embrioni appena deposti non hanno un corone completamente sviluppato e appaiono bianchi. Utilizzare carta da filtro nera durante la procedura per facilitare la visualizzazione degli embrioni bianchi.</li>
	<li>Trasferire un piccolo gruppo di femmine dal vaso di gesso alla camera di deposizione delle uova attraverso le porte laterali utilizzando un aspiratore di bocca. La presenza di un substrato umido (la carta filtrante) induce le femmine a ovoposit.</li>
	<li>Dopo 30-60 minuti, recuperare con cura la carta filtrante con embrioni appena posati dalla camera. Conservare la carta filtrante e gli embrioni in una piastra di Petri per un massimo di 3 ore. Durante questo periodo, valutare regolarmente il livello di umidità della carta da filtro per assicurarsi che rimanga umida. Durante questo periodo, ripetere i passaggi da 2.4 a 2.6 con nuovi gruppi di femmine e raccogliere il maggior numero possibile di embrioni.</li>
	<li>Preparare le diapositive al microscopio per l'iniezione: raccogliere manualmente le uova una per una con un pennello molto fine e trasferirle con cura su un altro pezzo di carta filtrante nera umida posta su uno scivolo al microscopio sormontato da un copripazzo di vetro.<ol>
<li>Aggiungere acqua alla carta filtrante, abbastanza da mantenere gli embrioni umidi ma non facendoli galleggiare lontano dal coverslip o essere succhiati sotto il coverslip. Allinea gli embrioni contro il copriscivolo. Il coverslip funge da backstop impedendo alle uova di rotolare via durante l'iniezione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Iniezioni di embrioni (Figura 3)
<ol><li>Inizia le iniezioni da 2,5 a 3 ore dopo l'inizio della raccolta delle uova. Eseguire iniezioni a temperatura ambiente e umidità ambiente di laboratorio.</li>
	<li>Assicurarsi che gli embrioni allineati abbiano abbastanza acqua in modo che siano mantenuti umidi. NOTA: È fondamentale che gli embrioni siano mantenuti umidi durante le iniezioni. Se non sono umidi durante il processo di iniezione, le iniezioni diventano difficili perché l'ago ha difficoltà a perforare l'embrione. La corretta quantità di acqua è il punto in cui gli embrioni hanno un menisco d'acqua intorno a loro, ma il coverslip non galleggia sopra l'acqua causando la spinta degli embrioni sotto il coverslip. È fondamentale monitorare la quantità di acqua intorno agli embrioni durante le iniezioni. Aggiungere acqua se necessario per mantenere gli embrioni umidi.</li>
	<li>Aggiungere l'acqua con cura bagnando un pennello con acqua e trasferendo l'acqua sul retro della carta filtrante. L'aggiunta di acqua in questo modo consente di aggiungere acqua in modo lento e controllato in modo che venga aggiunto quanto basta per mantenere gli embrioni umidi. Troppa acqua può far galleggiare gli embrioni fuori allineamento, rendendo difficile iniettare gli embrioni.</li>
	<li>Miscela di iniezione di carico posteriore nell'ago di microiniezione. Aggiungere circa 0,5 a 1 μL di miscela di iniezione nell'ago utilizzando un riempitivo ad ago borosilicato disegnato a mano, è anche possibile utilizzare punte di pipetta di caricamento in gel. La miscela di iniezione è composta da uno o più RNA guida (80 ng/μL ciascuno) progettati per colpire uno specifico locus mescolato con la proteina Cas9 ricombinante commerciale (300 ng/μL).</li>
	<li>A partire dalla pressione di iniezione a 30 psi, premere il grilletto di iniezione per espellere l'aria dalla punta dell'ago. Ciò costringerà la miscela di iniezione alla punta dell'ago permettendo al mix di iniezione di fluire. A questo punto, aumentare lentamente la pressione di tenuta / costante fino a quando il materiale di iniezione inizia a fluire, quindi di nuovo fuori dalla tenuta / pressione costante in modo che sia appena sotto il punto della miscela di iniezione che scorre dall'ago. L'impostazione recintata dovrebbe fornire abbastanza materiale di iniezione in modo che si possa vedere una piccola quantità di materiale per entrare nell'embrione. NOTA: L'iniezione di embrioni di mosca di sabbia sotto olio di alocarbonio simile ad altri protocolli utilizzati per drosofilia e zanzare è stata inizialmente testata, tuttavia la percentuale di sopravvivenza per queste iniezioni era molto bassa. La sopravvivenza è stata migliorata passando alle iniezioni su carta filtrante umida come descritto sopra.</li>
	<li>Inserire l'ago nel lato dell'embrione. Utilizzare il copripasta dietro l'embrione come backstop che aiierà l'ago a perforare l'embrione. Fornire una piccola quantità di miscela di iniezione nell'embrione prima di rimuovere delicatamente l'ago.</li>
	<li>Immediatamente dopo la rimozione dell'ago, premere l'iniettore per rimuovere qualsiasi materiale riempito di nuovo dalla punta dell'ago. Questo aiuterà a prevenire l'intasamento dell'ago.</li>
	<li>Procedi verso l'embrione successivo. Tra ogni iniezione, assicurarsi che la carta filtrante sia umida e che l'ago non sia intasato.</li>
	<li>Una volta che tutti gli embrioni sono stati iniettati, contare il numero di embrioni iniettati per mantenere un conteggio in esecuzione.</li>
	<li>Rimuovere il coverslip aggiungendo acqua alla carta filtrante in modo che il coverslip galleggi. A questo punto, utilizzare una sonda (bastoncino applicatore di legno con perno di insetto incollato alla punta) per tenere la carta filtrante in posizione mentre un dito viene utilizzato per allontanare il coperchio dagli embrioni iniettati.</li>
	<li>Togliere l'acqua in eccesso dalla carta filtrante una volta rimossa la copertina.</li>
</ol>4. Allevamento post-iniezione (G0)(figura 4)
<ol><li>Trasferire la carta filtrante con gli embrioni sopra diversi strati di carta filtrante umida posta in una piastra di Petri per mantenere l'umidità. Tieni qui gli embrioni durante il tempo necessario per iniettare altri embrioni. Gli embrioni possono essere trattenuti per un massimo di 3 ore come questo. Dopo l'iniezione diventano lentamente marroni.</li>
	<li>Una volta che tutti gli embrioni sono stati iniettati, trasferirli manualmente su vasi di gesso di piccole dimensioni precedentemente inumiditi. Non mettere troppi embrioni in ogni vaso e mantenere la distanza tra di loro, per evitare possibili contaminazioni fungine tra gli individui. Coprire i vasi con uno schermo e conservarli come sarebbe in genere fatto per le uova di colonia di mosca di sabbia, mantenute in incubatrici con umidità del 70% e 26 °C, durante il loro intero sviluppo.</li>
	<li>Il primo giorno dopo l'iniezione, rimuovere tutti gli embrioni danneggiati e morti con un pennello. Aggiungere 100 μL di acido propionico allo 0,5%, goccia a goccia, sui vasi di gesso contenenti gli embrioni iniettati per limitare la contaminazione fungina. Il rilascio di citoplasma da embrioni danneggiati durante il processo di iniezione è particolarmente favorevole alla crescita fungina.</li>
	<li>Controllare i vasi di gesso ogni giorno e rimuovere eventuali embrioni cattivi o morti. Se è presente il fungo, rimuovere tutti gli embrioni infetti e aggiungere alcune gocce di acido propionico 0,5%.</li>
	<li>Le larve si schiudono tra il giorno 8 e il 12 dopo l'iniezione. Due volte al giorno, trasferire le larve appena emerse su nuovi vasi di gesso, in gruppi di massimo 5-10. Aggiungi una piccola quantità di cibo e controlla il cibo 2-3 volte a settimana.<ol>
<li>Monitora attentamente la quantità di cibo larvale, poiché aumenta notevolmente il rischio di contaminazione fungina. Le larve di mosca della sabbia sopravvivono meglio in gruppi, tuttavia possono essere cannibali se non c'è abbastanza cibo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quando le larve si impupano, separale per sesso per mantenere le femmine come vergini. Se ci sono molti sopravvissuti, scarta i maschi e mantieni solo le femmine. NOTA: Sia i maschi che le femmine possono trasportare e trasmettere mutazioni. Tuttavia, poiché le femmine devono essere tenute vergini prima di essere incrociate, è più facile usare solo le femmine iniettate G0 per evitare di dover separare gli insetti wt dal sesso. I maschi G0 possono essere tenuti come riserva se il numero di sopravvissuti adulti è basso e in questo caso saranno accoppiati con femmine vergini wt ordinate.</li>
</ol>5. Selezione e screening degli alleli mutanti(figura 5)
<ol><li>Attraversa di massa le femmine G0 con i maschi wt in una gabbia. Nutrirli del tutto, come sarebbe stato fatto per il normale mantenimento della colonia.</li>
	<li>Un giorno dopo l'alimentazione del sangue, trasferire ogni femmina G0 con 2-3 wt maschi in singoli tubi di gesso usando un aspiratore bocca. Nutrire le mosche con lo zucchero su un piccolo batuffolo di cotone cambiato ogni giorno e utilizzare una siringa d'acqua per garantire che l'umidità dell'intonaco sia adatta per la deposizione delle uova.</li>
	<li>Dopo che le femmine del G0 hanno deposto le uova (corrispondenti al G1),raccolgono i loro corpi in tubi Eppendorf individuali annotati per il genotipizzazione successivo. Mantenere gli embrioni come di solito fatto per le colonie wt.</li>
	<li>Estrarre il DNA dalle femmine G0 con il metodo di scelta.</li>
	<li>Schermare il DNA per la presenza di mutazioni, ad esempio progettando un test PCR utilizzando primer che circondano la regione dei tagli CRISPR previsti.</li>
	<li>Conservare solo gli embrioni G1 deposti dalle femmine G0 mostrando prove di trasformazione. Quando questi embrioni G1 si sviluppano in pupe, separali per sesso e mantieni solo le femmine. Attraversare le femmine G1 dalla stessa femmina G0 ai maschi wt, nutrirle di sangue, quindi trasferirle in piccoli gruppi di 2-3 femmine e 4-5 maschi in contenitori di piccole dimensioni. NOTA: Tutti gli individui G1 hanno la possibilità di portare una mutazione unica, quindi se il numero di individui sopravvissuti non ètroppo alto, allora è meglio attraversare le femmine G 1 individualmente con i maschi wt. Il caso di diverse femmine che portano una mutazione diversa presente in uno stesso tubo è raro ma può verificarsi. Se tale caso viene osservato dopo il genotipizzazione, le femmine di progenie G2 devono quindi essere accoppiate individualmente ai maschi wt. Questo schema di accoppiamento evita la possibilità di mutazioni multiple nella progenie.</li>
	<li>Dopo la deposizione delle uova, raccogli i corpi femminili del G1 e cerca le mutazioni. Conservare solo i tubi in cui almeno una femmina ha mostrato prove di mutazione.</li>
	<li>Per le generazioni successive fare singole coppie in-crosses. Dopo la deposizione delle uova, scherma i genitori per la presenza di mutazione. Ripetere ad ogni generazione fino a quando entrambi i genitori sono omozigoti per la stessa mutazione. Una volta identificati, saranno i fondatori di uno stock mutante omozigote.</li>
</ol>

<ol>
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Presentiamo qui un metodo di microiniezione embrionale recentemente sviluppato per la mutagenesi mirata di CRISPR/Cas9 in mosche di sabbia Phlebotomus papatasi. La microiniezione embrionale per la modificazione genetica degli insetti è stata sviluppata in Drosophila a metà degli anni'80 21 ed è ora regolarmente utilizzata in un'ampia varietà di insetti. Altri metodi per la consegna di materiali di modificazione genetica sono stati sviluppati per l'uso negli insetti, come ReMO...

Le malattie trasmesse da vettori sono una delle principali minacce per la salute pubblica in costante evoluzione. Centinaia di specie vettoriali diffuse in famiglie filogeniche molto distinte (ad esempio, zanzare, zecche, pulci) sono responsabili della trasmissione di un numero enorme di agenti patogeni microbici, causando più di 700.000 morti umane all'anno, secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità. Tra gli insetti vettoriali, le mosche di sabbia flebotomina (Diptera, Psychodidae) costituiscono un vasto gruppo, con 80 specie vettoriali comprovate che mostrano tratti fenotipici distinti e capacità vettoriali presenti in diverse regioni geografiche. Sono vettori per i parassiti protozoi del genere Leishmania, causando circa 1,3 milioni di nuovi casi di leishmanie e tra i 20.000 e i 30.000 morti all'anno. Gli esiti clinici delle leishmanie sono diversi, con sintomi che vanno dalle lesioni cutanee autolimitanti alla diffusione viscerale che è fatale in assenza di trattamento.
Le mosche di sabbia sono insetti strettamente terrestri. Il loro ciclo di vita, relativamente lungo rispetto ad altri Ditteri, dura fino a tre mesi, a seconda di diversi parametri come temperatura, umidità e nutrizione. Consiste in uno stadio embrionale (da 6 a 11 giorni), quattro stadi larvali (della durata totale di 23-25 giorni) e uno stadio pupale (da 9 a 10 giorni) seguito da metamorfosi e poi età adulta. Le mosche di sabbia richiedono un ambiente umido e caldo per l'allevamento. Sia i maschi che le femmine si nutrono di zuccheri, ottenuti in natura dai nettari di fiori. Solo le femmine sono emoderivatrici, in quanto richiedono proteine ottenute dalla farina di sangue per la produzione di uova1.
Un obiettivo importante della ricerca è identificare la natura delle interazioni vettore / parassita che portano allo sviluppo di infezioni trasmissibili. Come per altri insetti vettoriali, i parametri intrinseci alle mosche di sabbia hanno dimostrato di influire sulla loro competenza vettoriale, che è definita come la loro capacità di trasportare e trasmettere agenti patogeni ai loro ospiti. Ad esempio, l'espressione delle galectine da parte delle cellule di phlebotomus papatasi sand fly midgut, agendo come recettori che riconoscono i componenti della superficie parassitaria, può influenzare direttamente la loro competenza vettoriale per la Leishmania major2,3. La via di risposta immunitaria degli insetti, ImmunoDeficiency (IMD), è anche cruciale per la competenza del vettore di mosca della mosca della sabbia Phlebotomus papatasi per Leishmania major4. Un ruolo critico per le vie di risposta immunitaria degli insetti vettoriali nel controllo della loro trasmissione di agenti patogeni infettivi è stato segnalato in modo simile nelle zanzare Aedes aegypti 5,6,7, nella mosca tse-tse Glossina morsitans8e nelle zanzare Gambiae Anopheles 9,10.
Gli studi sulle interazioni mosca di sabbia /Leishmania sono stati limitati dalla mancanza di metodi di modifica dell'espressione genica adattati per l'uso in questi insetti. Solo la downregolazione genica da parte di piccoli RNA interferenti (siRNA) erastata eseguita 11,12,13,14 fino a poco tempo fa. La tecnica, limitata dalla mortalità associata alla microiniezione delle femmine adulte, porta solo a una parziale perdita di funzione, che non può essere trasmessa di generazione in generazione.
La tecnologia CRISPR/Cas9 ha rivoluzionato la ricerca genomica funzionale in organismi non modello come le mosche della sabbia. Modificato dal sistema immunitario adattivo nei procarioti per la difesa contro i batteriofagi15,16, il sistema CRISPR Cas9 è stato rapidamente adattato come strumento di modifica del genoma per organismi eucarioti superiori, compresi gli insetti. Il principio dell'editing mirato del genoma CRISPR/Cas9 si basa sulla complementarietà di un singolo RNA guida (sgRNA) a uno specifico locus genomico. La nucleasi Cas9 si lega allo sgRNA e crea una rottura del DNA a doppio filamento (dsDNA) nel DNA genomico in cui lo sgRNA si associa alla sua sequenza complementare. Il complesso Cas9-sgRNA è guidato alla sequenza bersaglio da 17 a 20 basi complementari nello sgRNA al locus scelto, la rottura dsDNA può quindi essere riparata da due percorsi indipendenti: giunzione finale non omologa (NHEJ) o riparazione diretta dall'omologia (HDR)17. La riparazione NHEJ comporta una semplice chiusura dell'interruzione, ma spesso porta a piccoli eventi di inserimento / eliminazione. La riparazione del DNA attraverso l'HDR utilizza una molecola di DNA donatore che condivide l'omologia con il DNA bersaglio come modello per la riparazione. Gli insetti possiedono entrambi i macchinari.
La tecnologia CRISPR/Cas9 può generare mutazioni in un luogo scelto, attraverso la via di riparazione NHEJ; o per strategie di editing del genoma più complesse, come knock-in o giornalisti di espressioni, attraverso il percorso HDR con un modello di donatore appropriato. Nelle mosche di sabbia, gli alleli mutanti nulli del fattore di risposta immunitaria Relish sono stati generati attraverso CRISPR mediato da NHEJ in Phlebotomus papatasi4. Gli embrioni di mosca della sabbia sono stati iniettati anche in un altro studio con un mix CRISPR / Cas9 che prende di mira il gene che codifica giallo. Tuttavia, nessun adulto portatore della mutazione è statoprodotto 18. Descriviamo qui un metodo dettagliato di mutagenesi mirata della mosca della sabbia da CRISPR/Cas9 mediata da NHEJ, con particolare attenzione alla microiniezione embrionale, una fase critica del protocollo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Black Filter Paper 4.25CM PK100</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28342-012</td>
			<td>Cut into rectangles that are approximately 46 X 22mm. These are placed between the slide and the coverslip and act as a moist base layer for the embryos during injection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-543A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>For aligning embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-A3</td>
			<td>Base layer of the microinjection set up Figure 2A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect cage</td>
			<td>custom made or several commercial options</td>
			<td></td>
			<td>polycarbonate cage for adults holding and mating Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. &#8220;Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).&#8221; Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Larval food</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
			<td>a mix of rabbit chow and rabbit feces Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. &#8220;Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).&#8221; Parasite 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcaps 100 ml</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>1-000-1000</td>
			<td>Used to back fill microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouth aspirator</td>
			<td>John W. Hock Company</td>
			<td>Model 612</td>
			<td>mouth aspirator with HEPA filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus SZX12</td>
			<td>Olympus Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>Microinjection microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovipots</td>
			<td>Nalge company</td>
			<td></td>
			<td>ovipots are made from 125-ml or 500-ml straigh-sided plolypropylene jars modified by drilling 2.5cm holes in the bottom and filled with 1cm of plaster of Paris. Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. &#8220;Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).&#8221; Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint Brush 6-0</td>
			<td>Any Art Supply Company</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Used for aligning embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>402907</td>
			<td>antifungal agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-3</td>
			<td>Used for making microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trio-MPC100 Controller and MP845 Manipulator</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Microinjection Controller and Micromanipulator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sand fly (phlebotomus papatasi) embryo microinjection for crispr/cas9 mutagenesis

Le mosche di sabbia sono i vettori naturali per le specie di Leishmania, i parassiti protozoici che producono un ampio spettro di sintomi che vanno dalle lesioni cutanee alla patologia viscerale. Decifrare la natura delle interazioni vettore/parassita è di primaria importanza per una migliore comprensione della trasmissione della Leishmania ai loro ospiti. Tra i parametri che controllano la competenza del vettore della mosca della sabbia (cioè la loro capacità di trasportare e trasmettere agenti patogeni), i parametri intrinseci a questi insetti hanno dimostrato di svolgere un ruolo chiave. La risposta immunitaria degli insetti, ad esempio, influisce sulla competenza vettoriale della mosca della sabbia in Leishmania. Lo studio di tali parametri è stato limitato dalla mancanza di metodi di modifica dell'espressione genica adattati per l'uso in questi organismi non modello. La downregolazione genica da parte di un piccolo RNA interferente (siRNA) è possibile, ma oltre ad essere tecnicamente impegnativa, il silenziamento porta solo a una perdita parziale della funzione, che non può essere trasmessa di generazione in generazione. La mutagenesi mirata della tecnologia CRISPR/Cas9 è stata recentemente adattata alla mosca di sabbia Phlebotomus papatasi. Questa tecnica porta alla generazione di mutazioni trasmissibili in un luogo appositamente scelto, permettendo di studiare i geni di interesse. Il sistema CRISPR/Cas9 si basa sull'induzione di rotture mirate di DNA a doppio filamento, successivamente riparate da NHEJ (Non-Homologous End Joining) o da Homology Driven Repair (HDR). NHEJ consiste in una semplice chiusura dell'interruzione e spesso porta a piccoli eventi di inserimento / eliminazione. Al contrario, l'HDR utilizza la presenza di una molecola di DNA donatore che condivide l'omologia con il DNA bersaglio come modello per la riparazione. Qui, presentiamo un metodo di microiniezione embrionale mosca di sabbia per la mutagenesi mirata da PARTE di CRISPR / Cas9 utilizzando NHEJ, che è l'unica tecnica di modifica del genoma adattata ai vettori di mosca della sabbia fino ad oggi.

Il protocollo di microiniezione CRISPR/Cas9 qui descritto per generare mutanti di mosca di sabbia è stato stabilito in una precedente pubblicazione4. Questo approccio produsse una mutagenesi altamente efficiente, poiché 11 individui su 540 sopravvissero alla procedura, di cui 9 mutanti. Quando si progettano guide per la mutazione CRISPR/Cas9, un primo passo critico consiste nel sequenziare la regione intorno all'area da prendere di mira. Il modello per il sequenziamento dovrebbe essere dal ceppo...

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Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Questo protocollo descrive in dettaglio le fasi della mutagenesi mirata CRISPR/Cas9 nelle mosche della sabbia: raccolta, iniezione, allevamento e identificazione degli insetti, nonché selezione di mutazioni di interesse.

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Microiniezione embrionale per CRISPR/Cas9 Mutagenesi

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

7.0K Views.  National Institutes of Health. Questo protocollo descrive in dettaglio le fasi della mutagenesi mirata CRISPR/Cas9 nelle mosche della sabbia: raccolta, iniezione, allevamento e identificazione degli insetti, nonché selezione di mutazioni di interesse.

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Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the African clawed frog, Xenopus, a longstanding model organism for biomedical research. Traditional breeding schemes for creating homozygous mutant lines with CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis have several time-consuming and laborious steps. To facilitate the creation of mutant embryos, particularly to overcome the obstacles associated with knocking out genes that are essential for embryogenesis, a new method called leapfrogging was developed. This technique leverages the robustness of Xenopus embryos to &#34;cut and paste&#34; embryological methods. Leapfrogging utilizes the transfer of primordial germ cells (PGCs) from efficiently-mutagenized donor embryos into PGC-ablated wildtype siblings. This method allows for the efficient mutation of essential genes by creating chimeric animals with wildtype somatic cells that carry a mutant germline. When two F0 animals carrying &#34;leapfrog transplants&#34; (i.e., mutant germ cells) are intercrossed, they produce homozygous, or compound heterozygous, null F1 embryos, thus saving a full generation time to obtain phenotypic data. Leapfrogging also provides a new approach for analyzing maternal effect genes, which are refractory to F0 phenotypic analysis following CRISPR/Cas9 mutagenesis. This manuscript details the method of leapfrogging, with special emphasis on how to successfully perform PGC transplantation.

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Genes essential for survival pose technical hurdles for creating mutant lines. Leapfrogging circumvents lethality by combining genome editing with primordial germ cell transplantation to create wild-type animals carrying germline mutations. Leapfrogging also permits the efficient generation of homozygous null mutants in the F1 generation. Here, the transplantation step is demonstrated.

Trapianto di cellule germinali primordiali per basati su CRISPR/Cas9 rincorsa in Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

Ricerca

Genetica

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene function. Gene knockout has been used to study these gene functions in vivo. The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system is a powerful tool used to edit genomic DNA sequences to alter gene function. While the traditional approach has been to introduce CRISPR/Cas9 mRNA into the single cell embryos through microinjection, this can be a slow and inefficient process in catfish. Here, a detailed protocol for microinjection of channel catfish embryos with CRISPR/Cas9 protein is described. Briefly, eggs and sperm were collected and then artificial fertilization performed. Fertilized eggs were transferred to a Petri dish containing Holtfreter's solution. Injection volume was calibrated and then guide RNAs/Cas9 targeting the toll/interleukin 1 receptor domain-containing adapter molecule (TICAM 1) gene and rhamnose binding lectin (RBL) gene were microinjected into the yolk of one-cell embryos. The gene knockout was successful as indels were confirmed by DNA sequencing. The predicted protein sequence alterations due to these mutations included frameshift and truncated protein due to premature stop codons.

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

A simple and efficient microinjection protocol for gene editing in channel catfish embryos using the CRISPR/Cas9 system is presented. In this protocol, guide RNAs and Cas9 protein were microinjected into the yolk of one-cell embryos. This protocol has been validated by knocking out two channel catfish immune-related genes.

Microinjection di proteine CRISPR/Cas9 in Channel Catfish, Ictalurus punctatus, embrioni per Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration of transgenes. However, due to the low efficiency of homologous recombination (HR) and various indel mutations of non-homologous end joining (NHEJ)-based strategies in non-dividing cells, in vivo genome editing remains a great challenge. Here, we describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based CRISPR/Cas9 system for efficient in vivo precise targeted integration. In this system, the targeted genome and the donor vector containing homology arms (~800 bp) flanked by single guide RNA (sgRNA) target sequences are cleaved by CRISPR/Cas9. This HMEJ-based strategy achieves efficient transgene integration in mouse zygotes, as well as in hepatocytes in vivo. Moreover, a HMEJ-based strategy offers an efficient approach for correction of fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) mutation in the hepatocytes and rescues Fah-deficiency induced liver failure mice. Taken together, focusing on targeted integration, this HMEJ-based strategy provides a promising tool for a variety of applications, including generation of genetically modified animal models and targeted gene therapies.

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system provides a promising tool for genetic engineering, and opens up the possibility of targeted integration of transgenes. We describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based strategy for efficient DNA targeted integration in vivo and targeted gene therapies using CRISPR/Cas9.

Integrazione mirata CRISPR/Cas9-mediata In Vivo usando una strategia basata su unendo fine omologia-mediata

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

Microinjection di embrione e tecnica di trapianto per la manipolazione del genoma di Nasonia vitripennis

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been co-opted as a powerful tool for precise eukaryotic genome engineering. Here, we present a rapid and simple method using chimeric single guide RNAs (sgRNA) and CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) for the efficient and precise generation of genomic point mutations in C. elegans. We describe a pipeline for sgRNA target selection, homology-directed repair (HDR) template design, CRISPR-Cas9-RNP complexing and delivery, and a genotyping strategy that enables the robust and rapid identification of correctly edited animals. Our approach not only permits the facile generation and identification of desired genomic point mutant animals, but also facilitates the detection of other complex indel alleles in approximately 4 - 5 days with high efficiency and a reduced screening workload.

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Here, we present a method to engineer the genome of C. elegans using CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins and homology dependent repair templates.

Un veloce e Facile Pipeline per generazione di mutanti di punto Genomic in c. elegans utilizzando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteine

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical regions, is caused by infection with Plasmodium parasites. The development of more effective drugs to combat malaria can be accelerated by improving our understanding of the biology of this complex parasite. Genetic manipulation of these parasites is key to understanding their biology; however, historically the genome of P. falciparum has been difficult to manipulate. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been utilized in malaria parasites, allowing for easier protein tagging, generation of conditional protein knockdowns, and deletion of genes. CRISPR/Cas9 genome editing has proven to be a powerful tool for advancing the field of malaria research. Here, we describe a CRISPR/Cas9 method for generating glmS-based conditional knockdown mutants in P. falciparum. This method is highly adaptable to other types of genetic manipulations, including protein tagging and gene knockouts.

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

We describe a method for generating glmS-based conditional knockdown mutants in Plasmodium falciparum using CRISPR/Cas9 genome editing.

CRISPR/Cas9 Gene Editing per rendere la mutanti condizionali del parassita di Malaria umana da p. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or C-terminal fluorescent tags. The prokaryotic CRISPR/Cas9 system (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9) may be used to introduce large exogenous sequences into genomic loci via homology directed repair (HDR). To achieve the desired knock-in, this protocol employs the ribonucleoprotein (RNP)-based approach where wild type Streptococcus pyogenes Cas9 protein, synthetic 2-part guide RNA (gRNA), and a donor template plasmid are delivered to the cells via electroporation. Putatively edited cells expressing the fluorescently tagged proteins are enriched by fluorescence activated cell sorting (FACS). Clonal lines are then generated and can be analyzed for precise editing outcomes. By introducing the fluorescent tag at the genomic locus of the gene of interest, the resulting subcellular localization and dynamics of the fusion protein can be studied under endogenous regulatory control, a key improvement over conventional overexpression systems. The use of hiPSCs as a model system for gene tagging provides the opportunity to study the tagged proteins in diploid, nontransformed cells. Since hiPSCs can be differentiated into multiple cell types, this approach provides the opportunity to create and study tagged proteins in a variety of isogenic cellular contexts.

Described here is a protocol for tagging endogenously expressed proteins with fluorescent tags in human induced pluripotent stem cells using CRISPR/Cas9. Putatively edited cells are enriched by fluorescence activated cell sorting and clonal cell lines are generated.

Proteina endogena Tagging in umani hanno indotto le cellule staminali pluripotenti utilizzando CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of CRISPR/Cas9 elements into the target cells by transfection is a prerequisite for efficient gene editing. This protocol demonstrates that tube electroporation (TE) machine-mediated delivery of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP), along with single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) donor templates to different types of mammalian cells, leads to robust precise gene editing events. First, TE was applied to deliver CRISPR/Cas9 RNP and ssODNs to induce disease-causing mutations in the interleukin 2 receptor subunit gamma (IL2RG) gene and sepiapterin reductase (SPR) gene in rabbit fibroblast cells. Precise mutation rates of 3.57%-20% were achieved as determined by bacterial TA cloning sequencing. The same strategy was then used in human iPSCs on several clinically relevant genes including epidermal growth factor receptor (EGFR), myosin binding protein C, cardiac (Mybpc3), and hemoglobin subunit beta (HBB). Consistently, highly precise mutation rates were achieved (11.65%-37.92%) as determined by deep sequencing (DeepSeq). The present work demonstrates that tube electroporation of CRISPR/Cas9 RNP represents an efficient transfection protocol for gene editing in mammalian cells.

Presented here is a protocol for efficient CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-mediated gene editing in mammalian cells using tube electroporation.

CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteina-mediato Precision Gene Editing da Elettroporazione Tube

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise heterozygous genetic modifications is challenging due to CRISPR-CAS9 mediated indel formation in the second allele. Here, we demonstrate a protocol to help overcome this difficulty by using two repair templates in which only one expresses the desired sequence change, while both templates contain silent mutations to prevent re-cutting and indel formation. This methodology is most advantageous for gene editing coding regions of DNA to generate isogenic control and mutant human stem cell lines for studying human disease and biology. In addition, optimization of transfection and screening methodologies have been performed to reduce labor and cost of a gene editing experiment. Overall, this protocol is widely applicable to many genome editing projects utilizing the human pluripotent stem cell model.

This protocol provides a method to facilitate the generation of defined heterozygous or homozygous nucleotide changes using CRISPR-CAS9 in human pluripotent stem cells.

Generazione di modifiche genomiche definite utilizzando CRISPR-CAS9 nelle cellule staminali pluripotenti umane

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species alike. This technology can be used for a variety of genome editing approaches, from gene knockouts and knockins to more specific changes like the introduction of a few nucleotides at a targeted location. Genome editing can be used for a multitude of applications, including the partial functional characterization of genes, the production of transgenic organisms and the development of diagnostic tools. Compared to previously available gene editing strategies, the CRISPR-Cas9 system has been shown to be easy to establish in new species and boasts high efficiency and specificity. The primary reason for this is that the editing tool uses an RNA molecule to target the gene or sequence of interest, making target molecule design straightforward, given that standard base pairing rules can be exploited. Similar to other genome editing systems, CRISPR-Cas9-based methods also require efficient and effective transformation protocols as well as access to good quality sequence data for the design of the targeting RNA and DNA molecules. Since the introduction of this system in 2013, it has been used to genetically engineer a variety of model species, including Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster and Mus musculus. Subsequently, researchers working on non-model species have taken advantage of the system and used it for the study of genes involved in processes as diverse as secondary metabolism in fungi, nematode growth and disease resistance in plants, among many others. This protocol detailed below describes the use of the CRISPR-Cas9 genome editing protocol for the truncation of a gene involved in the sexual cycle of Huntiella omanensis, a filamentous ascomycete fungus belonging to the Ceratocystidaceae family.

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is an easy-to-use genome editor that has been used in model and non-model species. Here we present a protein-based version of this system that was used to introduce a premature stop codon into a mating gene of a non-model filamentous ascomycete fungus.

CrispR-Cas9-Mediato Genome Editing nel Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...