L'attuale protocollo di imaging SEM fornisce uno strumento per visualizzare e quantificare la formazione di volant di membrana, sporgenze circolari e coppe macropinocitiche sulla superficie cellulare in vitro. SEM fornisce immagini ad alta risoluzione della superficie cellulare che possono essere utilizzate per visualizzare le attività della membrana macropinocitica. Questa tecnica può essere utilizzata per scoprire nuove vie di segnalazione che regolano la macropinocitosi e identificare nuovi stimolatori e inibitori della micropinocitosi.
Inizia posizionando i coperchi di vetro sterili scivolando nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti usando una pinza autoclavata. Quindi seminare 264,7 macrofagi crudi sulla copertura scivola a una densità di 10-sesta cella per millilitro e incubare la piastra durante la notte in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il giorno seguente, sostituire i media in ogni pozzo con 500 microlitri di mezzi freschi completi, quindi pretrattare i macrofagi per 30 minuti con un controllo del veicolo come DMSO o un inibitore della macropinocitosi come eIPA.
Successivamente, per promuovere l'arruffamento della membrana, trattare le cellule per 30 minuti con stimolatori della macropinocitosi, come una soluzione di PMA monoparolare o 100 nanogrammi per millilitro di fattore stimolante della colonia di macrofagi. Per fissare le celle per la microscopia elettronica a scansione, aspirare il fluido dai pozzetti e lavare due volte gli scivoli di copertura con PBS ghiacciato, quindi incubare il coperchio scivola in un fissativo per 30 minuti a temperatura ambiente seguito da incubazione notturna a quattro gradi Celsius. Il giorno seguente, senza disturbare il monostrato cellulare, lavare delicatamente e quindi incubare gli scivoli di copertura in 500 microlitri di cacodilato di sodio 0,1 motori per 15 minuti.
Dopo due lavaggi con 500 microlitri di acqua distillata, lavare il coperchio scivola due volte in 500 microlitri di una serie di etanolo graduato con un'incubazione di 10 minuti in ogni lavaggio. Per eseguire l'essiccazione del punto critico, posizionare gli slip del coperchio in un essiccatore a punto critico e coprirli con etanolo al 100%. Quindi, premere il pulsante di accensione e aprire il serbatoio di anidride carbonica.
Premere il pulsante di raffreddamento per circa 30 secondi fino a quando la temperatura scende a zero gradi Celsius. Quindi, premere il pulsante di riempimento fino a quando non viene visualizzata una bolla nella finestra della camera. Quindi, premere il pulsante di spurgo fino a quando l'odore di etanolo dallo scarico di spurgo scompare.
Quindi, premere nuovamente il pulsante di raffreddamento fino a quando la temperatura non scende a zero gradi Celsius. Premere nuovamente i pulsanti Completo ed Elimina per disattivarli. Quindi, chiudere il serbatoio di anidride carbonica.
Premere nuovamente il fondo freddo per spegnerlo, quindi premere il pulsante di calore. Impostare la temperatura a 42 gradi Celsius e la pressione a 1.200 libbre per pollice quadrato. Una volta che la pressione e la temperatura si sono stabilizzate, premere il pulsante di spurgo per consentire alla pressione di diminuire lentamente.
Una volta che la pressione della camera raggiunge i 150 libbre per pollice quadrato, premere il fondo di sfiato e attendere che la pressione diminuisca a zero libbre per pollice quadrato. Spegnere l'essiccatore del punto critico e rimuovere gli scivoli del coperchio. Successivamente, utilizzando rubinetti adesivi in carbonio, montare gli slip di copertura sui supporti del campione di alluminio per la microscopia elettronica a scansione, quindi procedere al rivestimento sputter utilizzando oro o palladio in un rivestimento sputter.
Accendere il pulsante di accensione del coater sputter. Dopo che il vuoto raggiunge i 30 millitorrs, lavare la camera per rimuovere l'umidità e l'aria spegnendo l'interruttore del gas e ruotando la valvola del gas fine in senso antiorario. Una volta che il vuoto aumenta a 200 millitorrs, spegnere l'interruttore del gas e attendere che il vuoto raggiunga i 30 millitorrs.
Quindi, lavare nuovamente la camera per rimuovere l'umidità e l'aria come dimostrato. Dopo aver lavato la camera tre volte, premere il fondo del timer e regolare la manopola di tensione fino a quando l'indicatore legge 10 milliampere. Quindi, rimuovere gli scivoli di copertura rivestiti dalla camera.
Per visualizzare e quantificare le increspature della membrana, inserire il coperchio del campione scivola nella camera di un microscopio elettronico a scansione, chiudere la porta e premere il pulsante evac. Aprire il software operativo del microscopio e impostare la tensione di accelerazione a 15 kilovolt e la distanza di lavoro a 10 millimetri. Premere il pulsante Coordinate e spostarsi all'interno del controller finché le celle non vengono visualizzate al centro della schermata di osservazione.
Impostare l'ingrandimento su 3.500 X e visualizzare l'immagine del campione facendo clic sul pulsante Foto. Qui sono mostrate immagini rappresentative al microscopio elettronico a scansione, che dimostrano la formazione di volant di membrana in 264,7 macrofagi grezzi dopo trattamento con PMA e fattore stimolante la colonia di macrofagi. Il pretrattamento dei macrofagi con l'inibitore della macropinocitosi EIPA attenua la formazione di increspature di membrana.
Durante la formazione del volant, la membrana plasmatica subisce fasi morfologiche distinte, tra cui una protrusione di membrana simile a un foglio, un volant di membrana a forma di C e una coppa macropinocitica. La formazione di increspature di membrana dopo i trattamenti con fattori stimolanti la PMA e le colonie di macrofagi può essere quantificata utilizzando la microscopia elettronica a scansione, mentre la formazione di macropinosomi può essere confermata da tecniche di imaging alternative, come la microscopia confocale con destrano rosso del Texas e FM4-64. Le frecce blu indicano l'arruffamento della membrana, mentre le frecce gialle e verdi puntano ai micropinosomi.
Infine, la macropinocitosi può essere confermata e quantificata attraverso la citometria a flusso utilizzando un marcatore di fase fluida fluorescente come FITC o Texas red dextran. Oltre alla SEM, è possibile eseguire anche l'imaging di cellule vive e l'analisi citometrica a flusso dell'internalizzazione del destrano marcata fluorescentemente per indagare e quantificare la macropinocitosi.
