In video, presentiamo un protocollo per la congelamento-fratturazione di vescicole extracellulari provenienti da cellule tumorali della vescica in vitro. Le vescicole extracellulari sono vescicole limitate alla membrana che derivate dalle cellule vengono rilasciate nello spazio extracellulare e hanno un ruolo nella comunicazione intercellulare. All'interno delle vescicole extracellulari, discriminiamo tre popolazioni, esosomi, microvescicole e corpi apoptotici, che differiscono per origine, dimensioni e composizione molecolare.
La composizione molecolare delle vescicole extracellulari riflette il profilo molecolare della cellula donatrice e interferisce con i processi biologici nella cellula ricevente. Tuttavia, la composizione della membrana limitante delle vescicole cellulari è cruciale per l'interazione con la membrana cellulare ricevente. Per analizzare l'organizzazione della membrana limitante, le vescicole extracellulari devono essere prima isolate e quindi avvicinate alla tecnica di congelamento-frattura.
La congelo-frattura è una tecnica al microscopio elettronico dedicata allo studio dell'organizzazione bidimensionale delle membrane biologiche, comprese le vescicole. Le fasi della fratturazione del congelamento sono il congelamento rapido del campione, la fratturazione del campione, la realizzazione della replica della superficie fratturata congelata e la pulizia della replica per rimuovere materiali biologici. Le repliche vengono infine visualizzate con il microscopio elettronico a trasmissione.
Il nostro obiettivo era quello di utilizzare la tecnica della frattura da congelamento per caratterizzare le microvescicole in termini di forma, dimensioni e composizione della membrana. Inizia con le cellule in crescita nell'incubatore cellulare. Ispezionare le cellule al microscopio per confermarne la variabilità e la confluenza.
Raccogliere i terreni di coltura con microvescicole in tubi e centrifugare a 300 g-forze per 10 minuti. Colleziona surnatante. Successivamente, centrifuga surnatante a 2000 g-forze e 10.000 g-forze.
Successivamente, osservare la punta del tubo per un pellet biancastro che indica microvescicole. Rimuovere con attenzione il surnatante. Aggiungere 1,5 millilitri di PBS e sospendere nuovamente il pellet contenente microvescicole.
Quindi centrifugare a 10.000 g-forze. Osservare per il pellet biancastro. Rimuovere il surnatante e aggiungere delicatamente fissativo.
Lasciare agire per 20 minuti a 4 gradi Celsius. Quindi rimuovere il fissativo e aggiungere il tampone di lavaggio per risciacquare il pellet senza sospenderlo nuovamente. Lasciare agire per 10 minuti a 4 gradi Celsius.
Rimuovere il tampone di lavaggio e aggiungere il 30% di glicerolo al pellet. Sospendere nuovamente il pellet in sospensione omogenea e incubare per 30 minuti a 4 gradi Celsius. Preparare supporti di rame puliti con una fossa centrale e sviluppare un pallone con cipiglio e azoto liquido.
Al microscopio, trasferire il campione nella fossa centrale del supporto di rame. Mescolare il freon solidificato per diventare liquefatto. Afferrare l'anello esterno del supporto con una pinzetta e immergerlo nel freon raffreddato.
Dopo otto secondi trasferire rapidamente il supporto in un pallone di sviluppo con azoto liquido. Mark cryo vile e raffreddarlo. Sotto azoto liquido raccogliere i vettori nel vile, chiuderlo e conservare nel contenitore di azoto liquido fino a congelare la fratturazione.
Preparare l'unità di frazione di congelamento secondo le istruzioni operative del produttore. Avviare il sistema di vuoto e raffreddare la camera dell'unità a meno 150 gradi Celsius. Trasferire i supporti di rame con il campione congelato nell'unità di congelamento-frazionamento.
Impostare la temperatura del coltello a meno 100 gradi Celsius e attendere il vuoto. Iniziare a sezionare il campione attivando il movimento motorizzato del coltello fino a quando la superficie del campione non è liscia. Per la fratturazione spegnere il movimento motorizzato del coltello e procedere con il lento controllo manuale del coltello.
Procedere con l'ombreggiatura in platino con l'angolo di 45 gradi. Accendere l'alta tensione e aumentare la corrente alla pistola di platino. Scintille di platino dovrebbero iniziare a ombreggiare il campione.
Supervisionare la posizione del platino sul monitor dello spessore del cristallo di quarzo. Lo spessore consigliato del platino è di 2,5 nanometri. Spegnere la corrente e l'alta tensione.
Procedere con l'ombreggiatura del carbonio con un angolo di 90 gradi. Accendere l'alta tensione e aumentare la corrente alla pistola in carbonio. Scintille di carbonio dovrebbero iniziare a mettere in ombra il campione.
Quando si ottengono 2,5 nanometri di carbonio, spegnere la corrente e l'alta tensione. Trasferire quei campioni con le repliche dall'unità di congelamento-frattura a una piastra a 12 valvole riempita con acqua a doppia distillazione. Le repliche galleggieranno sulla superficie dell'acqua mentre i vettori affondano.
Trasferire le repliche con anello di filo a una piastra a 12 valvole riempita con ipoclorito di sodio e incubare durante la notte. Lavare le repliche in acqua a doppio distillato. Raccoglieteli su una griglia TM in rame a rete e lasciateli asciugare all'aria per due ore.
Utilizzare un microscopio elettronico a trasmissione per visualizzare repliche e ottenere micrografie. Per un'interpretazione accurata di repliche e micrografie, seguire le linee guida per il corretto orientamento sulla nomenclatura. Le analisi delle repliche hanno mostrato che il mezzo isolato-condizionato conteneva una frazione arricchita di vescicole.
Le vescicole isolate sono state raccolte in gruppi di tre o più o distribuite molto individualmente. Le vescicole erano di forma sferica. Il diametro delle vescicole corrispondeva al diametro delle microvescicole.
La fratturazione del congelamento ha anche rivelato un'organizzazione bidimensionale della membrana delle microvescicole. La fase esoplasmatica delle microvescicole aveva un aspetto liscio e uniforme, mentre nella fase dei protoplasti abbiamo osservato particelle intermembrana. Le particelle inter-membrana sono apparse sporadicamente, il che implica che le microvescicole isolate dalle cellule del materiale tumorale contengono solo una bassa quantità di proteine di membrana o assemblaggi proteici.
Per riassumere, la tecnica di congelamento-frattura utilizzata nel protocollo presentato si rivela una tecnica ottimale per la caratterizzazione di vescicole extracellulari e può essere utilizzata per la valutazione di altre popolazioni di vescicole extracellulari. Un vantaggio cruciale della tecnica di congelamento-frattura è il suo potere di risolvere l'organizzazione interna della membrana che limita le vescicole, che determina la funzione biologica delle vescicole extracellulari.
