Questo protocollo è significativo perché consente agli utenti di preparare campioni di mitocondri da tessuti congelati raccolti da studi precedenti e archiviati. Questo protocollo riduce anche l'uso di animali vivi per la raccolta dei tessuti. Questa tecnica consente agli utenti di utilizzare tessuti di archivio precedentemente congelati per preparare campioni arricchiti di mitocondri utilizzando un metodo di triturazione dei tessuti delicati.
Questo metodo di preparazione massimizza la resa della preparazione dei mitocondri. Attraverso la lettura del protocollo è consigliabile garantire la disponibilità di tutti i componenti e gli strumenti in particolare l'azionamento a trituratore completamente carico e anche esercitare con alcuni tessuti indesiderati per familiarizzare con i passaggi. A dimostrare la procedura sarà Edina Kosa, ricercatrice associata del mio laboratorio.
Per cominciare, registrare il peso del tubo contenente il tessuto cardiaco. Ora pesare il tubo vuoto e sottrarlo dal peso precedentemente registrato per ottenere un peso netto del tessuto cardiaco. Mettere il tessuto cardiaco congelato direttamente nel becher della soluzione ghiacciata.
Mescolare per cinque minuti. Contemporaneamente usando una pinzetta applicare una leggera pressione sul tessuto per estrarre più sangue possibile. Estrarre il tessuto con una pinza e spremere il cuore con un tovagliolo di carta da filtro pulito per rimuovere il sangue.
Quindi posizionare il tessuto in un altro becher di soluzione ghiacciata. Dopo aver mescolato il tessuto per cinque minuti, asciugare delicatamente il tessuto su un tovagliolo di carta e rimuovere il grasso, il sangue coagulato, i padiglioni auricolari e le fasce. Raggruppare il tessuto ventricolare.
Per triturare i campioni di tessuto, posizionare da 50 a 300 milligrammi di tessuto cardiaco nella camera del trituratore di tessuti dal lato dell'ariete e chiudere il lato dell'ariete. Quindi aggiungere da 0,2 a 0,8 millilitri di tampone di lavaggio sul lato del cappuccio del tubo. Utilizzare lo strumento tubo per tappare la camera del trituratore con il cappuccio del trituratore in modo aderente senza serrarlo eccessivamente.
Posizionare la camera di triturazione nell'unità portatritura con il lato dell'ariete verso il basso per il montaggio innestato. Inserire e innestare la punta del driver del trituratore completamente carico con il cappuccio del trituratore assicurando che la punta sia comodamente bloccata in posizione, quindi applicare la pressione sul driver del trituratore nella camera del trituratore fino a quando l'indicatore di pressione sul supporto del trituratore raggiunge un'impostazione di circa due. Premere il grilletto ed eseguire il driver del trituratore per circa 10-12 secondi mantenendo l'impostazione a due.
Osservare il tubo per garantire la triturazione e il passaggio di tutta o la maggior parte della massa di tessuto attraverso il disco di lisi nella camera superiore del trituratore e, se necessario, restituire il tubo al supporto del trituratore per continuare la triturazione. Dopo la triturazione del campione, sollevare la camera di triturazione dall'unità portante e utilizzare lo strumento del tubo per rimuovere il tappo del trituratore e posizionarlo su una superficie pulita per un uso successivo raccomandato solo all'interno dello stesso campione per evitare la contaminazione incrociata da altri campioni di tessuto. Trasferire il tessuto cardiaco triturato nel terzo becher con 40 millilitri di tampone di lavaggio con una barra di agitazione e mescolare il tessuto per cinque minuti a una velocità media mentre si è sulla piastra di agitazione.
Filtrare la sospensione attraverso un monofilamento in rete di nylon pre-bagnato. Dopo aver scartato il filtrato lavare il tessuto triturato sul filtro tre volte con 10 millilitri di tampone di lavaggio. Trasferire il tessuto lavato in un becher da 50 millilitri con 20 millilitri di tampone di lavaggio posto nel bagno di ghiaccio sulla agitazione magnetica.
Aggiungere 0,5 millilitri di soluzione di tripsina mescolando costantemente per 15 minuti. Circa a metà dell'agitazione trasferire la sospensione tissutale in un omogeneizzatore portatile vetro su vetro liberamente montato che può contenere 15 millilitri di volume. Omogeneizzare la sospensione con quattro o cinque colpi delicati senza produrre schiuma.
Quindi, posizionare l'omogeneizzato in un becher da 50 millilitri e mescolare su una piastra di agitazione. Quindi, aggiungere 10 millilitri del tampone di isolamento contenente inibitore della tripsina all'omogeneizzato e incubare mescolando delicatamente. Dopo aver filtrato nuovamente la sospensione attraverso un filtro in nylon, salvare il filtro in un tubo conico da 50 millilitri e trasferire la frazione di particolato rimasta sul filtro all'omogeneizzatore vetro su vetro.
A 15-20 millilitri del tampone di lavaggio e omogeneizzare delicatamente con la mano per 25-30 secondi. Dopo aver combinato l'omogeneizzato con il filtrato e bilanciato i tubi, centrifugare e quindi utilizzare una pipetta di plastica rimuovere il surnatante lasciando 0,2 millilitri dalla parte superiore del pellet soffice. Filtrare il surnatante risultante in un nuovo tubo conico utilizzando un filtro in nylon per evitare la contaminazione e centrifugare ancora una volta.
Dopo aver scartato il surnatante lavare il pellet due o tre volte aggiungendo il tampone di isolamento sul lato del tubo per evitare di rompere o contaminare il pellet. Scartare ogni volta il soffice strato bianco del bordo esterno. Aggiungere cinque millilitri del tampone di isolamento a ciascun tubo e rompere il pellet usando una pipetta con una punta di un millilitro o una nuova pipetta di trasferimento Quindi diluire la sospensione con 20 millilitri di tampone di isolamento aggiuntivo e centrifugare la sospensione a 8.500 X g per 15 minuti a quattro gradi Celsius.
Dopo aver scartato il surnatante, risospese il pellet prima in cinque millilitri e poi in altri 15 millilitri del tampone di risospesso e centrifuga a 8.500 X g per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Ora scartare il surnatante e salvare il pellet marrone contenente mitocondri intatti lavati. Risospesso il pellet arricchito con mitocondri in 250 microlitri del tampone di riusaspendimento, compresi gli inibitori della proteasi.
Aliquotare la sospensione in un volume di 25 microlitri, congelare rapidamente in azoto liquido e conservare in un congelatore a 80 gradi Celsius per diversi anni. Seguendo il protocollo la proteina arricchita con mitocondri è stata preparata dal cuore della prole nata da due gruppi di scrofe. Uno è stato esercitato durante la gravidanza e l'altro era sedentario.
L'analisi del profilo proteico ETC ha rivelato che la progenie delle scrofe esercitate presentava livelli relativamente ridotti in alcuni dei complessi ETC. Le proteine mitocondriali sono state risolte in un gradiente BN-PAGE dal 3 all'8% e immunoprobed con cocktail di anticorpi. Sia i gruppi esercitati che quelli sedentari presentano più supercomplessi.
L'aumento supercomplesso prominente osservato è stato a nove mesi nel gruppo esercitato rispetto al gruppo sedentario. Proteine arricchite con mitocondri ottenute da diverse fasce di età di 48 ore tre mesi, sei mesi e nove mesi sono state analizzate per l'attività del Complesso I-II utilizzando un test cinetico. Il gruppo esercitato ha mostrato un'attività complessa I-II rispetto a quella del gruppo sedentario.
La fattibilità di studi funzionali sui mitocondri ottenuti da tessuti e cellule congelati è dimostrata da altri ricercatori. La preparazione dei mitocondri ottenuti da tessuto congelato può essere applicata per un'ampia varietà di tessuti con danni minimi.
