Questa procedura è altamente sensibile e consente una visualizzazione di diverse trascrizioni con uno sfondo minimo. Questo metodo può generare mappe accurate del profilo trascrizionale di tipi cellulari altamente eterogenei. A dimostrare la procedura saremo io e Johnson Bob-manuel, un tecnico di ricerca in laboratorio.
Inizia raccogliendo l'intera massa gangliare vagale dal topo di otto settimane da ciascun lato, con l'aiuto di un cannocchiale di dissezione e strumenti chirurgici. Dopo la decapitazione del topo, utilizzare una piccola pinza per rimuovere lo sternoioide e i muscoli omoioidi laterali alla trachea per esporre l'osso occipitale. Liberare l'intera regione di muscoli e tessuti fino a quando l'arteria carotide, il nervo vago e ipoglosso e il forame magno sono visibili.
Quindi tagliare l'intero nervo ipoglosso con piccole forbici a molla. Individuare il ganglio nodoso come massa traslucida vicino al forame magno. Usando piccole forbici, rompere con cura l'osso occipitale.
Per esporre ulteriormente il ganglio giugulare, individuare i melanociti neri sulla superficie della giugulare come punto di riferimento visivo. Quando i gangli vengono trovati, tagliare gli attacchi nervosi tra la massa gangliare vagale e tirare delicatamente l'estremità periferica del nervo vago mentre contemporaneamente si taglia il ganglio giugulare verso il tronco cerebrale con piccole forbici a molla per l'estrazione dell'intera massa gangliare. Rimuovere il tessuto congiuntivo, la massa gangliare e il grasso che si attaccano al nervo vago.
Mantenere circa mezzo centimetro del nervo vago per facilitare la manipolazione e la localizzazione dei campioni. Posizionare il passaggio ai gangli con l'aiuto di pinze fini in tubi micro centrifuga da 1,5 millimetri. E incubare a quattro gradi Celsius in formalina per 24 ore.
E poi con il 30% di saccarosio per 24 ore. Dopo l'incubazione, posizionare i gangli all'interno di una goccia di quattro millimetri di diametro di mezzo a temperatura di taglio ottimale su un pezzo di foglio di alluminio. E frase il campione su un letto di ghiaccio secco.
Tagliare i campioni congelati con un criostato in sezioni di 14 micrometri di spessore a meno 20 gradi Celsius e raccogliere le sezioni tagliate sui vetrini del microscopio di vetro come tre serie a 42 micrometri di distanza. Risciacquare i vetrini con sezioni di tessuto in PBS. E cuocere per 30 minuti a 60 gradi Celsius in un forno da forno.
Quindi, postfiggere le diapositive in formalina al 4% per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Disidratare in serie i vetrini in etanolo al 50%70% e al 100% per cinque minuti ciascuno. E applicare la soluzione di perossido di idrogeno ai campioni per 10 minuti prima di risciacquare in acqua doppia distillata.
Per l'ibridazione in situ, o ISH, trattare i campioni con il reagente di recupero target per cinque minuti. Quindi risciacquare sequenzialmente i campioni in acqua doppia distillata e 100% etanolo seguito da essiccazione all'aria. Usando una penna idrofoba, crea una barriera attorno ai campioni.
Mentre i campioni vengono trattati con proteasi per 30 minuti a 40 gradi Celsius e un forno di ibridazione, preriscaldare le sonde a 40 gradi Celsius e raffreddarle a temperatura ambiente prima dell'uso. Dopo essersi spostati dal forno, incubare i vetrini con la combinazione desiderata di sonde target per due ore a 40 gradi Celsius in un forno di ibridazione. Incubare il tessuto di controllo negativo con la diidrodipicolinato reduttasi o DapB, sonda C1 target per due ore a 40 gradi Celsius.
Risciacquare i vetrini nel tampone di lavaggio e conservare in cinque volte il citrato di sodio salino a temperatura ambiente durante la notte. Il giorno successivo, sciacquare i vetrini con tampone di lavaggio prima dell'incubazione con reagenti di amplificazione. E trattare con reagenti specifici del canale come descritto nel manoscritto.
Lavare le diapositive seguite dal trattamento con DapB per 30 secondi. Quindi applicare immediatamente il mezzo di montaggio su ogni diapositiva e posizionare un coperchio sulla sezione del tessuto. Mantenere i tessuti orizzontali in un supporto per vetrini a quattro gradi Celsius fino all'imaging.
Preparare un microscopio confocale per l'imaging impostando i parametri richiesti. Acquisisci le immagini con una linea media di quattro e una dimensione in pixel di almeno 1024 per 1024 per migliorare la qualità delle immagini. Una volta soddisfatti dei parametri di acquisizione, iniziare ad acquisire le immagini utilizzando le stesse impostazioni.
Attribuire falsi colori a ciascun canale per facilitare la visualizzazione. Utilizzando le immagini digitali, eseguire il conteggio delle cellule identificando il contorno dei profili positivi dell'ambito dell'RNA con un nucleo leggermente macchiato di DapB. Calcola la percentuale di profili positivi dell'ambito dell'RNA che esprimono ogni trascrizione.
I parametri di acquisizione ottimali sono stati scelti per ciascun laser in base alla fluorescenza aspecifica ottenuta nel tessuto di controllo negativo. La fluorescenza endogena nel ganglio nodoso di un topo giovane adulto è minima. E l'incubazione con una sonda DapB, non ha provocato segnali.
Con una maggiore potenza laser e guadagno con il laser a 488 nanometri, appaiono sfondi indesiderati e punti fluorescenti casuali. La tecnica dell'ambito dell'RNA è stata applicata per rilevare tre geni in sezioni tissutali della massa gangliare vagale. Il profilo tissutale è risultato positivo per GHSR e CCK1R.
Il profilo includeva entrambi i trascritti Phox2b e CCK1R nella parte rostrale del ganglio nodoso. Come risultato dell'ISH multiplex nei neuroni afferenti nodosi, i segnali Phox2b si accumulano specificamente nei neuroni afferenti, situati nel ganglio nodoso. I segnali CCK1R marcano intensamente molti neuroni nel ganglio nodoso.
A basso ingrandimento, le cellule che esprimono bassi segnali CCK1R o GSHR non possono essere osservate facilmente. DapB ha aiutato a visualizzare il tessuto e identificare i neuroni afferenti vagali con un nucleo grande e leggermente macchiato. Ad alto ingrandimento, i profili positivi phox2b sono evidenti.
I profili due e tre sono cellule Phox2b con segnali CCK1R alti e moderati. Il profilo quattro esprimeva sia GHSR che CCK1R. Come risultato dell'ISH multiplex dei neuroni afferenti giugulari, la trascrizione PRDM12 potrebbe essere vista specificamente accumulata nei neuroni afferenti situati nel ganglio giugulare.
Ad alto ingrandimento, segnali moderati per CCK1R sono stati rilevati nei profili uno e due. Il profilo tre è un rappresentante delle cellule PRDM12 negative per CCK1R o GHSR. La coerenza della dissezione è un fattore importante.
È altrettanto importante verificare che i parametri di acquisizione dell'imaging non generino segnali di fondo indesiderati. L'ibridazione multiplex in situ è diventata il gold standard in ambito molecolare stabilito, specialmente nel campo della neuroanatomia. Questo metodo può essere facilmente combinato con l'immunoistochimica.
