Le due tecniche di peeling qui dimostrate isolano i singoli compartimenti subcellulari dell'asta e possono aiutare a rivelare gli importanti processi fisiologici che si verificano in ciascun compartimento specializzato in bastoncelli sani e malati. Isolare diversi compartimenti cellulari dell'asta dalla retina del topo può essere difficile. Queste semplici tecniche utilizzano materiali di laboratorio economici e comuni per isolare in modo affidabile i compartimenti subcellulari dell'asta per l'analisi delle proteine.
Per iniziare, metti un pezzo di carta da filtro in una capsula di Petri piena di tampone Ames HEPES bollito con ossigeno al 100%. Quindi, utilizzando una pipetta di trasferimento a foro largo, trasferire un rettangolo retinico sezionato da un mouse C57 Black 6J di due o tre mesi. Orientare la retina partizionata concava verso l'alto e assicurarsi che i fotorecettori siano rivolti verso il basso verso il fondo del piatto.
Quindi, usando una pinzetta, afferrare leggermente i lati della retina dimezzata e spostarla sopra la carta da filtro. Una volta centrata la retina, spostare la carta da filtro verso l'alto in modo che la retina dimezzata tocchi la carta da filtro per creare il segmento esterno dell'asta o ROS per l'adesione della carta da filtro. Sollevare con attenzione la carta da filtro con la retina collegata dal tampone Ames HEPES.
Posizionare il lato inferiore della carta da filtro su un tovagliolo di carta e tamponare due o tre volte per asciugare. Aggiungere una goccia di Ames HEPES sul lato della carta da filtro con la retina e posizionare nuovamente la carta da filtro sul tovagliolo di carta per asciugare. Quindi, riposizionare la carta da filtro con la retina nella capsula di Petri e, usando una pinzetta, spingere delicatamente tutti i bordi della retina dimezzata verso l'alto e lontano dalla carta da filtro su tutti i lati.
Staccare delicatamente la retina dalla carta da filtro, toccando solo il perimetro estremo della retina per preservarne l'integrità strutturale. Quindi, sollevare la carta da filtro dalla capsula di Petri e rimuovere il liquido in eccesso su un tovagliolo di carta, assicurandosi che il lato a contatto con la retina non contatti il tovagliolo di carta. Posizionare la carta da filtro con lo strato ROS parziale in un tubo etichettato su ghiaccio e mantenere la retina sbucciata immersa nel tampone Ames HEPES.
Ripetere il processo di peeling per questa retina dimezzata circa sette-otto volte per rimuovere l'intero strato ROS. Dopo ogni peeling, posizionare la carta da filtro nello stesso tubo per combinare tutti i ROS isolati da una retina dimezzata. Tenere il tubo contenente tutte le bucce di carta da filtro del ROS isolato su ghiaccio per un uso immediato.
Usando una pinzetta, trasferire la retina pelata rimanente in un tubo opportunamente etichettato e mantenere il tubo sul ghiaccio per un uso immediato. Per preparare il campione retinico per la liofilizzazione, posizionare un pezzo di carta da filtro e trasferire una retina dimezzata in una capsula di Petri piena di tampone di Ringer freddo. Successivamente, usando una pinzetta, capovolgere con attenzione la retina in modo che sia orientata verso l'alto e spostarla per appoggiarla sopra la carta da filtro.
Sollevare la carta da filtro dai bordi verso l'alto in modo che il pezzo di retina dimezzato tocchi la carta da filtro. Continuare a sollevare la carta da filtro dalla soluzione di Ringer. Quindi, posizionare il lato inferiore della carta da filtro su un tovagliolo di carta e tamponare con cura due o tre volte per rimuovere il liquido in eccesso.
Quindi, raccogliere la carta da filtro con una pinzetta e aggiungere una goccia di Ringer freddo sul lato della carta da filtro con la retina. Ancora una volta, posizionare la carta da filtro sul tovagliolo di carta per rimuovere il liquido in eccesso. Conservare ogni campione di retina e carta da filtro aderente in una capsula di Petri piena di suonerie fredde fino al momento di congelare tutti i campioni.
Quindi, usando una pinzetta, sollevare ogni campione dal buffer della suoneria fredda, assicurandosi che le pinzette entrino in contatto solo con i bordi della carta da filtro, evitando la retina dimezzata. Posizionare il lato inferiore di ogni carta da filtro su un tovagliolo di carta per rimuovere il liquido in eccesso. Quindi, aggiungere una goccia di PBS freddo sul lato della carta da filtro in cui la retina è aderente e tamponare nuovamente la carta da filtro sul tovagliolo di carta.
Posizionare tutti i pezzi di carta da filtro nella capsula di Petri e, utilizzando carta velina priva di lanugine, allontanare il liquido in eccesso che circonda la carta da filtro. Quindi, avvolgere strettamente l'intero piatto con un foglio di alluminio e assicurarsi che i bordi del foglio di alluminio siano fissati e premuti uniformemente sul fondo della capsula di Petri. Forare una manciata di fori da 0,1 a 0,2 millimetri nel coperchio del foglio di alluminio.
Successivamente, utilizzando pinze metalliche, abbassare gradualmente la capsula di Petri ricoperta di foglio di alluminio in azoto liquido. Conservare i campioni in azoto liquido fino al momento della liofilizzazione. Per la liofilizzazione, posizionare la capsula di Petri ricoperta di foglio di alluminio in un pallone di liofilizzazione e collegarla alla macchina liofilizzante seguendo il protocollo del produttore.
Liofilizzare la retina per 30 minuti. Dopo la liofilizzazione, raccogliere il segmento esterno e interno dell'asta posando con cura un piccolo pezzo di nastro adesivo sulla parte superiore della retina liofilizzata e applicando una leggera pressione con le pinzette per assicurarsi che si leghi con lo strato di fotorecettore. Staccare lentamente il nastro e assicurarsi che sia il ROS che il RIS abbiano aderito al nastro.
Un sottile film bianco sarà presente sulla superficie fratturata. Questo è il RIS. Per separare questo RIS, posizionare un altro pezzo di nastro e spingere il nastro verso il basso sulla superficie fratturata.
Quindi, posizionare il pezzo di nastro con solo lo strato rosa-arancio in un tubo microcentrifuga etichettato come ROS e pezzi di nastro con il sottile strato bianco in un altro tubo etichettato RIS. Successivamente, usando il nastro adesivo, raccogliere il tessuto retinico rimanente situato sulla carta da filtro staccando lo spesso strato bianco. Quindi, posizionare questo isolato in un tubo etichettato OIS.
Se si utilizza lo stesso giorno, conservare gli strati isolati dalla retina liofilizzata a temperatura ambiente. Negli animali adattati al buio, la distribuzione di GNAT1 e ARR1 corrispondeva strettamente alle loro distribuzioni di stato oscuro conosciute, dove il segnale GNAT1 era visibilmente più forte nell'isolamento ROS e il segnale ARR1 era più robusto nell'isolamento ROS. La quantificazione dei segnali GNAT1 e ARR1 ha mostrato differenze significative tra le condizioni di luce scura per GNAT1 e ARR1 nei campioni ROS e ROS.
Sia nei campioni scuri che in quelli adattati alla luce, i segnali G beat 5S, citocromo C e actina sono esclusi dai campioni ROS, dimostrando un'assenza di contaminazione da altri strati cellulari. Inoltre, il segnale G beta 5L era chiaramente visibile nei campioni ROS. La microscopia elettronica a scansione delle superfici della retina liofilizzata intatta e sbucciata ha dimostrato che, prima del peeling con nastro adesivo, la superficie della retina liofilizzata intatta corrispondeva strettamente al caratteristico ROS cilindrico.
Dopo la desquamazione iniziale del nastro, il ROS e il RIS sembravano essere completamente rimossi, come dimostra lo strato nucleare uniforme presente sulla superficie della retina liofilizzata, sbucciata e pelata. Le successive sbucciature del nastro hanno rimosso RIS dalla superficie libera dello strato pelato. Questa tecnica ha anche dimostrato che l'immunoreattività GRK1 era più intensa nei campioni ROS nella retina esposta alla luce e assente nei campioni OIS.
Al contrario, i campioni ROS e RIS hanno mostrato un debole segnale per PKC alfa, che comunemente non viene rilevato in ROS o RIS mediante colorazione di immunofluorescenza. Infine, il peeling del nastro non ottimale potrebbe produrre campioni leggermente contaminati. Il campione RIS è stato contaminato da alcuni campioni OIS, producendo sia le bande G beta 5L che G beta 5S e un segnale alfa PKC più elevato.
Bisogna fare attenzione quando si liofilizza la retina. Se viene utilizzata una tecnica di liofilizzazione impropria, la retina può sciogliersi, rendendo impossibile l'isolamento di diversi strati subcellulari di bastoncelli tramite nastro. L'utilizzo di questo metodo di peeling del nastro in combinazione con la qRT-PCR ha permesso la separazione dei trascritti dei fotorecettori dal resto della retina.
