Questo protocollo è progettato per isolare rapidamente le cellule dalle interfacce di screening per la caratterizzazione genomica e questa capacità è significativa perché può combinare le caratteristiche cellulari osservabili macroscopicamente con le informazioni genomiche. Le cellule batteriche mirate dalle interfacce di screening possono essere isolate con un'elevata posizione spaziale in modo operativamente semplice utilizzando questa tecnica. Gli idrogel possono essere implementati in altre interfacce di screening.
Il materiale idrogel può essere facilmente incorporato in canali microfluidici per il recupero su richiesta di cellule da dispositivi microfluidici. Iniziare inoculando il tampone di reticolazione con la densità cellulare desiderata. Preparare la soluzione precursore dell'idrogel in un tubo microcentrifuga da 0,5 millilitri aggiungendo 12,5 microlitri del tampone reticolante e 5,6 microlitri della soluzione di diacrilato PEG ONB.
E infine, aggiungere 6,9 microlitri di soluzione tiolica PEG dell'avambraccio alla miscela. Per l'incapsulamento cellulare nella soluzione precursore dell'idrogel, posizionare i coperchi della base tiolata su una capsula di Petri pulita e posizionare due distanziali sui due lati opposti del coperchio. Fissare i distanziali sulla coverlip di base legando i distanziali alla piastra di Petri.
Dopo aver aggiunto il volume desiderato della soluzione precursore su un vetrino perfluoroalchilato non reattivo, posizionare il vetrino sul coperchio di base e lasciare che la formazione di idrogel si completi a temperatura ambiente per 25 minuti. Una volta completata la gelificazione, rimuovere delicatamente il vetrino perfluoroalchilato. Posizionare il substrato nella capsula di Petri da 60 x 15 millimetri contenente mezzi ATGN integrati con antibiotico.
Seminare 700 microlitri di sospensioni cellulari batteriche con OD 600 di 0,1 sul substrato dell'array di microwell e produrre la soluzione precursore dell'idrogel come dimostrato in precedenza utilizzando 12,5 microlitri di ATGN salino tamponato con fosfato di pH otto. Pipettare 12,5 microlitri della soluzione precursore su un vetrino perfluoroalchilato non reattivo e posizionare due distanziatori in acciaio da 38 micrometri su due lati opposti del substrato dell'array di microwell innoculato con celle. Quindi capovolgere il vetrino perfluoroalchilato con la goccia di soluzione precursore e posizionare una goccia al centro del substrato del microwell.
Quando l'idrogel si forma dopo un'incubazione di 25 minuti a temperatura ambiente, rimuovere delicatamente il vetrino dal substrato del microwell e posizionare il substrato in una capsula di Petri contenente mezzi ATGN integrati con antibiotico. Posizionare il campione in un supporto PDMS e aggiungere il supporto definito sopra il campione per prevenire la disidratazione del campione e fornire una soluzione portante per le cellule rilasciate. Dopo aver portato lo specchio di calibrazione in posizione, regolare la messa a fuoco del microscopio per ottenere un'immagine nitida delle colonie all'interno dell'array di idrogel o microwell e ispezionare per identificare colonie o pozzi di interesse.
Qui, progetta i modelli di luce mentre la vista della telecamera mostra le colonie all'interno del campione per testare diversi modelli per l'estrazione delle cellule e salvare il modello definito. Quindi selezionare la sezione di controllo della sessione, aggiungere la sequenza salvata nella scheda intitolata con il nome del prodotto dello strumento di illuminazione a motivi geometrici. Scegliere l'opzione per stimolare il modello per visualizzare e regolare la posizione di esposizione desiderata.
Quindi, regolare l'intensità della luce al 60% e il tempo di esposizione a 40 secondi nella scheda di controllo LED e avviare il processo di esposizione. Monitorare la degradazione dell'idrogel in tempo reale e in modalità Brightfield per garantire il rilascio della cella. Per raccogliere la cellula rilasciata, cambiare il filtro del microscopio da Brightfield a TRITC per visualizzare l'area esposta del campione ad occhio nudo.
Una volta individuata l'area esposta, posizionare l'estremità del tubo sul punto irradiato, quindi riportare il filtro del microscopio a Brightfield per monitorare il recupero delle cellule in tempo reale. Utilizzare la siringa attaccata all'altra estremità del tubo per prelevare con cura 200 microlitri di soluzione contenenti le cellule rilasciate e trasferire la soluzione in un tubo centrifugo da 1,5 millimetri per l'analisi del DNA o la placcatura. Diversi micro modelli di luce UV sono stati utilizzati per l'estrazione cellulare da idrogel sfusi, che hanno influenzato la morfologia delle cellule rilasciate.
L'esposizione ai raggi UV in un modello ad anello ha provocato il rilascio dell'intera colonia incapsulata in un idrogel PEG protettivo. Al contrario, esponendo parte o tutta la colonia alla luce UV, le cellule potrebbero essere estratte come cluster di cellule aggregate o come singole cellule libere. La densità di semina cellulare e lo spessore dell'idrogel sono importanti per l'incapsulamento cellulare.
Gli idrogel più sottili hanno portato a micro colonie con una sovrapposizione minima di colonie, mentre gli idrogel con maggiore spessore hanno provocato colonie sovrapposte, che potrebbero comportare l'estrazione di più colonie. Le colonie sovrapposte possono causare contaminazione incrociata durante l'estrazione a causa della natura bidimensionale del modello di luce. Quando una colonia superiore è stata presa di mira, anche la colonia sottostante è stata estratta con essa.
È stato anche valutato l'effetto di vari modelli di micro luce UV sulla vitalità cellulare. Quando le micro colonie sono state esposte a dosi controllate di luce UV in un modello circolare o incrociato, il recupero cellulare e la purezza del DNA non sono stati influenzati. Le cellule sono state recuperate con successo da array di microwell utilizzando questo approccio, che era evidente dalle immagini rappresentative della microscopia confocale, dove dopo l'irradiazione nel modello circolare e ad anello, le cellule sono state rimosse nel rispettivo modello.
Dopo l'estrazione da array di microwell, sono state valutate la vitalità cellulare e la quantità di DNA. I modelli di esposizione non hanno influenzato né il conteggio delle cellule vitali né la qualità del DNA, indicando che le cellule batteriche vitali potrebbero essere recuperate selettivamente dai microwell con danni minimi e il loro DNA potrebbe essere isolato ad alta purezza per l'analisi genomica a valle. Controllare sempre che l'idrogel si sia formato prima di rimuovere il coverslip perfluoroalchilato.
Precisione e cura sono necessarie per posizionare i distanziali per la deposizione di idrogel e utilizzare i tubi per l'estrazione delle celle.
