Questo protocollo è significativo in quanto consente una manipolazione mirata specifica del tempo delle placente del topo utilizzando CRISPR. Ciò consentirà ai ricercatori di chiarire specifiche funzioni geniche durante la gravidanza da metà a fine gravidanza. Le manipolazioni genetiche che causano sovraespressione all'interno della placenta del topo sono molto rare.
Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente una serie di cambiamenti di espressione genica all'interno della placenta. Non scoraggiarti se i termini preliminari hanno questa tecnica non hanno successo. Poiché questa tecnica è impegnativa, richiede un bel po 'di tempo per esercitarsi a padroneggiare.
Per iniziare, posizionare la diga anestetizzata supina con un cono nasale per mantenere l'anestesia nell'area di preparazione. Rasare accuratamente l'addome della diga. Per prevenire l'essiccazione corneale, posizionare un gel lacrimale artificiale su entrambi gli occhi della diga.
Quindi utilizzare applicatori sterili con punta di cotone per disinfettare il sito chirurgico con almeno tre cicli alternati di una soluzione di povidone-iodio, seguiti da etanolo al 70% con una mano finale di soluzione di povidone-iodio. Dopo la preparazione, spostare la diga con il cono del naso dell'anestesia nell'area chirurgica designata. Per la laparotomia uterina, posizionare la dam supina sul tavolo operatorio e fissare il cono del naso in posizione con del nastro adesivo.
Posizionare una piastra riscaldante sotto un pad assorbente impostato a 45 gradi Celsius. Dopo aver confermato la profondità dell'anestesia attraverso la mancanza di reflusso del pizzico della punta, utilizzare pinze e forbici per effettuare un'incisione approssimativa della linea mediana di due centimetri attraverso la pelle tendata. Quindi fare un'incisione verticale attraverso il peritoneo usando una pinza sterile, delicatamente tesa lontano dalle corna uterine.
Massaggiare entrambe le corna uterine premendo su entrambi i lati dell'addome con le dita per guidarle. Posizionare l'utero esposto sopra i teli chirurgici sterili posizionati sopra l'addome inferiore e mantenerlo umido con gocce di soluzione salina sterile calda, se necessario. Una volta che l'utero è esposto, selezionare tre paia di placente per la manipolazione.
Registrare la posizione delle manipolazioni placentari e l'organizzazione degli embrioni all'interno delle corna uterine. Per l'iniezione placentare del plasmide di controllo, caricare una quantità sufficiente del plasmide di controllo appropriato per tre iniezioni utilizzando una micropipetta calibrata. Eseguire tutte le iniezioni tra la decidua e la zona giunzionale ad una profondità di circa 0,5 millimetri lateralmente nella placenta.
Dopo l'iniezione ma immediatamente prima dell'elettroporazione, rivestire i punti di contatto con soluzione salina sterile, applicando la soluzione salina precisamente ai tre siti sulla parete uterina e le pale con un contagocce o una siringa. Entro due minuti dall'iniezione, eseguire l'elettroporazione utilizzando una coppia di pale da tre millimetri collegate a una macchina per elettroporazione. Per garantire l'efficienza di incorporazione di CRISPR e la vitalità degli embrioni, regolare le impostazioni su 30 volt, impulso di 30 millisecondi, due impulsi, impulso di 970 millisecondi e unipolare.
Premere delicatamente le palette di elettroporazione sulle pareti uterine sui lati laterali della placenta. Posizionare la paletta anodica sul sito di iniezione e il catodo direttamente di fronte. Premere l'impulso sulla macchina per elettroporazione e attendere il completamento dei due impulsi prima di rimuovere le palette di elettroporazione.
Quindi procedere all'iniezione placentare del plasmide sperimentale come dimostrato in precedenza. Eseguire l'elettroporazione di tutte e tre le placente iniettate sperimentali entro due minuti dall'iniezione come eseguito per il gruppo di controllo. Una volta completata la manipolazione placentare, massaggiare delicatamente le corna uterine all'interno della cavità addominale usando solo le dita per manipolare direttamente le corna uterine.
Eseguire suture interrotte sullo strato di peritoneo utilizzando suture solubili rivestite e intrecciate lunghe 45 centimetri con una lega di aghi circolari da 13 millimetri, tre ottavi. Dopo aver suturato lo strato di peritoneo, suturare la pelle con suture solubili utilizzando lo stesso tipo di suture solubili utilizzate per il peritoneo. Una volta completata la sutura, applicare l'adesivo tissutale sulle suture sulla pelle.
Quando l'adesivo tissutale si è asciugato, spegnere il vaporizzatore e trasferire la diga dall'area chirurgica a una gabbia di supporto sul dorso. Le placente sono state iniettate con un plasmide di controllo generale CRISPR Cas9 e un plasmide CRISPR di controllo dell'attivazione o un plasmide di attivazione SAM IGF-1. Le immagini rappresentative post-necroscopia non hanno mostrato danni evidenti o cambiamenti nell'aspetto fenotipico in nessun gruppo di trattamento.
Il tasso di sopravvivenza degli embrioni non trattati nelle cucciolate manipolate è diminuito a una media del 79,05% mentre c'è stata una significativa diminuzione della sopravvivenza degli embrioni manipolati in media del 55,56% Non c'è stata alcuna differenza significativa nel peso placentare di nessun gruppo. Non c'era alcuna differenza significativa nell'aumento di peso materno immediatamente dopo l'intervento chirurgico rispetto agli interventi chirurgici fittizi. Molte madri gravide hanno mostrato una leggera diminuzione o nessun cambiamento di peso il giorno dopo la procedura, probabilmente a causa di un'interruzione del consumo durante e brevemente dopo l'intervento chirurgico.
La maggior parte delle dighe ha mostrato un aumento del peso su E14.5, ma occasionalmente è stata osservata una diminuzione del peso. La qPCR ha mostrato un aumento significativo dell'espressione di IGF-1 nelle placente di sovraespressione di IGF-1 rispetto alle placente di controllo. La valutazione ELIZA delle placente E14.5 ha mostrato un aumento significativo dei livelli di proteina IGF-1 nelle placente di sovraespressione di IGF-1 rispetto alle placente di controllo.
L'autofluorescenza verde ha dimostrato le sottoregioni dell'interfaccia fetale materna placentare con l'etichettatura rossa Cas9 solo nella placenta di sovraespressione di IGF-1, indicando il successo dell'incorporazione di CRISPR in tutte e tre le sottoregioni della placenta. La marcatura fluorescente nell'ibridazione C2 ha confermato l'incorporazione del plasmide di attivazione IGF-1 senza migrazione in placente non trattate. La zona deciduale e labirinto potrebbe essere identificata intorno alla zona giunzionale rossa contrassegnata dalla colorazione Prl8a8.
Ricordarsi di registrare il tipo di manipolazione e la posizione della placenta e degli embrioni corrispondenti. La registrazione della posizione della cervice e degli embrioni all'interno delle corna uterine è altamente raccomandata. A seguito di questa procedura, è possibile eseguire l'analisi della placenta, dell'embrione e della madre.
Ciò consentirà una maggiore comprensione dei ruoli specifici dei geni placentari in gravidanza, funzione placentare e sviluppo embrionale.
