È un protocollo facile e visualizzato che dimostra la gestione degli organoidi dell'adenocarcinoma esofageo in due diversi processi di sottocoltura con e senza digestione a singola cellula. Il protocollo standardizzato per la sottoculturazione degli organoidi EAC in due diversi metodi può supportare i ricercatori nella scelta di tecniche appropriate per diverse applicazioni a valle nei loro esperimenti basati su EAC PDO. Quando si tratta di DOP, è essenziale prestare attenzione ai dettagli in ogni passaggio.
Una SOP basata sul team è fondamentale per la qualità dei POD. A dimostrare la procedura saranno uno dei nostri dottorandi Ning Bo Fan e Lisa Raatz, assistente tecnica del laboratorio. Pre-riscaldamento una piastra a 12 pozzetti mediante incubazione notturna a 37 gradi Celsius utilizzando anidride carbonica.
Se disponibili, utilizzare pozzetti vuoti da una piastra con la coltura organoide derivata dal paziente. Incubare un volume appropriato di gel ECM per un'ora sul ghiaccio per liquefare. Posizionare la soluzione di recupero cellulare sul ghiaccio.
Rimuovere la piastra con DOP in crescita dall'incubatore. Aspirare il vecchio mezzo usando una pompa per vuoto. Aggiungere 500 microlitri per cupola di soluzione di recupero delle celle ghiacciate nel pozzo.
Disintegrare il gel ECM pipettando su e giù più volte per frammentare le cupole in gel ECM in piccoli pezzi utilizzando 1.000 punte di microlitro con un orifizio largo. Combinare il PDO, il gel ECM e la soluzione di recupero cellulare da un massimo di due pozzetti e trasferirlo in un tubo a legatura bassa di cinque millilitri. Incubare questo tubo sul ghiaccio per 20 minuti.
Mescolare ogni cinque minuti invertendo il tubo. Centrifugare il tubo ad una velocità di 500 volte G per quattro minuti a quattro gradi Celsius. Se non c'è pellet visibile, rimuovere con attenzione il surnatante con una pompa per vuoto fino a raggiungere la fase contenente la soluzione di gel ECM DOP e aggiungere tre millilitri di soluzione di recupero delle celle ghiacciate.
Capovolgere il tubo un paio di volte e incubare sul ghiaccio per altri 10 minuti. Centrifugare a 500 volte G per quattro minuti a quattro gradi Celsius. Scartare accuratamente il surnatante utilizzando una pompa per vuoto o una pipetta da 1.000 microlitri.
Cerca di rimuovere il surnatante il più possibile. Conservare il pellet DOP su ghiaccio. Rimuovere le punte pre-raffreddate a microlitri 201.000 con un orifizio largo dal congelatore a meno 20 gradi Celsius e posizionarle su una panca pulita.
Calcola 50 microlitri di gel ECM per cupola pianificata per la semina, più 50 microlitri extra. Quindi risospesciare il pellet in gel ECM utilizzando una punta pre-raffreddata da 1.000 microlitri e mescolare pipettando su e giù circa 10 volte. Rimuovere la piastra a 12 pozzetti preriscaldata dall'incubatrice prima di seminare le cupole.
Semina le cupole contenenti 50 microlitri di gel ECM nella piastra calda. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 20-30 minuti per solidificare il gel ECM. Aggiungere con attenzione il mezzo DOP preriscaldato senza disturbare le cupole.
Monitorare le DOP seminate al microscopio. Coltivare le DOP per 7-14 giorni fino a quando non si verificano la densità e la morfologia richieste. Preparare il mezzo di digestione mescolando due millilitri di 0,25% di tripsina EDTA e 20 microlitri DNAase I per digerire le DOP raccolte da due pozzi.
Risospendare il pellet precedentemente preparato in un volume appropriato di 0,25% di tripsina EDTA e DNAase I preriscaldati e mescolarlo circa 10 volte pipettando su e giù usando una pipetta da 1.000 microliti. Incubare per 10 minuti a 37 gradi Celsius in un incubatore rotante con una velocità di rotazione di almeno 28 RPM. Preparare un tubo da 15 millilitri contenente sei millilitri di soluzione di inibitore della tripsina di soia.
Dopo la digestione, mescolare accuratamente le DOP digerite un paio di volte con una pipetta da 1.000 microlitri per interrompere le DOP. Trasferire le DOP digerite nel tubo da 15 millilitri contenente la soluzione SDI per interrompere la digestione. Centrifugare a 500 volte G per quattro minuti a quattro gradi Celsius.
Scartare accuratamente il surnatante utilizzando una pompa per vuoto o una pipetta da 1.000 microlitri. Risospendare il pellet in un millilitro di mezzo basale. Determinare la concentrazione e la vitalità cellulare utilizzando un contatore cellulare automatizzato o un emocitometro.
Calcola il numero di celle in base alle cupole pianificate per la semina, più una cupola extra, e trasferiscile in un tubo a legatura basso da 1,5 millilitri fresco. Centrifugare a 500 volte G per quattro minuti a quattro gradi Celsius. Scartare con attenzione il surnatante usando una pipetta da 1.000 microlitri.
Aggiungere un volume appropriato di gel ECM al pellet utilizzando una punta dell'orifizio pre-raffreddata larga 1.000 microlitro. Mescolare pipettando su e giù circa 10 volte. Seminare le DOP digerite in una piastra a 12 pozzetti come dimostrato in precedenza.
Avviare il processo di crioconservazione delle DOP non digerite con pellet precedentemente preparato. Utilizzare 500 microlitri di mezzo di congelamento freddo per risospese il pellet da due cupole e trasferirlo in una fiala criogenica. Congelare le DOP durante la notte nel congelatore utilizzando un contenitore di congelamento delle celle appropriato.
Trasferire le DOP congelate in un congelatore a meno 150 gradi Celsius. Per la crioconservazione delle DOP digerite, trasferire le cellule in un tubo fresco a bassa legatura da 1,5 millilitri. Centrifugare a 500 volte G per quattro minuti a quattro gradi Celsius.
Scartare accuratamente il surnatante usando una pipetta da 1.000 microlitri. Risospendare il pellet in un mezzo di congelamento da 500 microlitri e trasferirlo in una fiala criogenica. Congelare le DOP durante la notte in un congelatore a meno 80 gradi Celsius utilizzando un contenitore di congelamento a celle appropriato e trasferirle in un congelatore a meno 150 gradi Celsius per la conservazione a lungo termine.
La subculturazione senza digestione monocellulare richiede meno tempo per raggiungere una densità comparabile e porta principalmente a strutture compatte. Al contrario, le DOP digerite a cellula singola mostrano strutture con un nucleo cavo. La figura mostra la colorazione dell'ematossilina eosina e la colorazione immunoistochimica delle DOP EAC incorporate nella paraffina con strutture compatte e cave.
La pancitocutina consente l'identificazione delle cellule tumorali epiteliali. La citocheratina 7 evidenzia le cellule tumorali ghiandolari differenziate. La struttura compatta esiste prevalentemente nella coltura non digerita, mentre la struttura cava è dominante nella coltura che ha subito la digestione unicellulare.
Il Ki67 evidenzia le popolazioni cellulari con maggiore proliferazione cellulare. Il Ki67 in rosso e il PanCK in verde sono stati distribuiti in modo simile tra tessuto primario EAC, struttura compatta EAC DOP e struttura cava EAC DOP. La figura mostra le caratteristiche morfologiche delle DOP EAC il primo giorno di recupero da stock congelati con crioconservazione a singola cellula e crioconservazione a base di DOP non digerita.
Ti consigliamo di fare un chiaro piano di sottocultura in anticipo. Il controllo della temperatura e il pipettaggio delicato sono essenziali per la corretta manipolazione dei gel ECM durante la subcoltura delle DOP. Il nostro protocollo fornisce ai ricercatori il sostanziale per mantenere le loro DOP EAC in base al loro scopo di studio per l'analisi a valle come il test di screening dei farmaci, la citometria a flusso o l'analisi istologica.
Speriamo che il nostro lavoro possa aiutare i ricercatori di organoidi a prendere decisioni rapide e facili per lo stoccaggio e la sottocoltura degli organoidi, in particolare per risultati robusti di materiali derivati dal paziente nella ricerca traslazionale.
