Questo protocollo può essere utile per affrontare domande sul ruolo dei plessi coroidi e delle cellule immunitarie periferiche nella regolazione del cervello in vari contesti in modelli murini. Questo protocollo consente un'analisi quantitativa e qualitativa approfondita delle popolazioni di cellule immunitarie uniche nei plessi coroidi dei topi. La dissezione dei plessi coroidi può essere difficile all'inizio a causa delle loro piccole dimensioni e del colore trasparente.
Raccomandiamo di esercitarsi prima su animali non perfusi. Per iniziare, posiziona il cervello sezionato da un lato dorsale di sei topi neri C57 in una capsula di Petri e posiziona il piatto sotto gli obiettivi delle anse binoculari. Mantenendo il cervello in posizione usando la pinza, inserire le due estremità di un'altra coppia di pinze verso il basso attraverso la linea mediana tra gli emisferi.
Usando la pinza, tirare la corteccia con il calloso e l'ippocampo lontano dal setto, esponendo il ventricolo laterale e una parte del terzo ventricolo. Identificare il plesso coroideo laterale come un lungo velo che riveste il ventricolo laterale e svasa ad entrambe le estremità. Quindi, utilizzando due estremità di pinze sottili, raccogliere il plesso coroideo laterale.
Fare attenzione a raccogliere la parte posteriore triangolare nascosta dalla piega posteriore dell'ippocampo. Quindi, tirare la corteccia con il corpo calloso e l'ippocampo dell'emisfero controlaterale lontano dal setto per esporre l'intero terzo ventricolo e il ventricolo laterale opposto. Usando una pinza fine, raccogli il terzo plesso coroideo identificato come una struttura corta con un aspetto superficiale granulare.
Quindi raccogliere l'altro plesso coroideo laterale. Quindi, inserire le due estremità della pinza tra il cervelletto e il mesencefalo e staccare il cervelletto dal ponte e dal midollo per esporre il quarto ventricolo. Quindi identificare il quarto plesso coroideo come una lunga struttura globulare con un aspetto superficiale granulare che riveste il quarto ventricolo dall'estremità laterale destra all'estremità sinistra tra il cervelletto e il midollo.
Usando una pinza fine, raccogli il quarto plesso coroideo. Dopo aver incubato tutti i plessi coroidi raccolti con collagenasi IV, pipettare delicatamente su e giù circa 10 volte per finalizzare la dissociazione. Quindi riempire il tubo a 1,5 millilitri con tampone MACS per interrompere l'attività della collagenasi IV.
Quindi, centrifugare le cellule e scartare il surnatante prima di lavare le cellule con 1,5 millilitri di tampone MACS. Dopo aver aggiunto le opportune perle di compensazione e le soluzioni anticorpali, incubare i campioni sul ghiaccio per 30-45 minuti, proteggendoli dall'esposizione alla luce. Quindi riempire i tubi con 1,5 millilitri di tampone MACS e centrifugare le celle e le perle di compensazione.
Dopo aver risospeso le cellule e le perle di compensazione in 500 microlitri di buffer MACS, filtrare le cellule attraverso un filtro da 70 micron. Dopo aver acceso il citometro a flusso e il software, selezionare l'area di dispersione in avanti rispetto all'area di dispersione laterale e il cancello per le cellule in base alle dimensioni. Quindi creare un gate figlio per celle singole con area di dispersione in avanti rispetto all'altezza di dispersione in avanti.
Quindi, creare un gate figlio per le cellule vive con DAPI rispetto all'area di dispersione in avanti per escludere le celle daPI positive. Quindi creare un gate figlio per le cellule immunitarie CD45 positive con CD45 rispetto all'area di dispersione in avanti. Ora, crea un gate figlio dalle cellule CD45 positive e seleziona F480 rispetto a CD11b per identificare le popolazioni CD11b positive F480 positive e CD11b positive F480 negative.
Quindi creare un gate figlio per le cellule positive F480 CD11b e selezionare CX3CR1 rispetto a IA-IE per identificare sia i macrofagi positivi IA-IE positivi al bordo CX3CR1 che i macrofagi negativi IA-IE positivi CX3CR1. Quindi, creare un gate figlia per CD11b positivo F480 CX3CR1 positivo IA-IE macrofagi negativi e selezionare F480 rispetto a CD11b per identificare sia il CD11b alto F480 intermedio CX3CR1 positivo IA-IE negativo Kolmer's epiplexus macrophages e CD11b positivo F480 alto CX3CR1 positivo IA-IE negativo border-associated macrofagi. Quindi dalla popolazione CD11b positiva F480 negativa, gate per Ly6C contro IA-IE.
Selezionare sia la popolazione Ly6C negativa IA-IE positiva che le cellule Ly6C positive IA-IE negative che corrispondono principalmente a monociti o neutrofili. Infine, creare un gate figlio per cd11b F480 negativo IA-IE ly6C negativo popolazione negativa e selezionare CD11b contro CX3CR1. Quindi identificare entrambe le popolazioni CD11b ad alto CX3CR1 basso e CD11b positivo CX3CR1 negativo.
Per il gating delle cellule T, dopo aver escluso le cellule DAPI positive come descritto in precedenza, creare un gate figlio per le cellule immunitarie CD45 positive con CD45 rispetto a FSC-A, quindi creare un gate figlio dalle cellule CD45 positive e selezionare TCR beta rispetto a CD11b. Escludere le cellule mieloidi CD11b positive e selezionare la popolazione di cellule T CD11b negative positive al TCR. Infine, creare un gate figlio per la popolazione TCR beta positiva CD11b negativa e selezionare CD4 contro CD8a.
Identificare sia le cellule T CD8 negative che CD4 positive e le cellule T CD4 negative CD8 positive. Le analisi di citometria a flusso qui dimostrate hanno rivelato con successo i principali sottoinsiemi di mieloidi e cellule T e il loro numero totale relativo per topo in modo altamente riproducibile. L'analisi della citometria a flusso delle cellule mieloidi mostra che il plesso coroideo è popolato da macrofagi CD11b CX3CR1 positivi F480 ad alto bordo, che rappresentano l'80% delle cellule immunitarie CD45 positive al plesso coroideo.
È stata inoltre identificata la popolazione cd11b intermedia F480 CX3CR1 positiva IA-IE negativa dei macrofagi epiplexus di Kolmer. Tra le cellule immunitarie CD11b positive F480 negative, sono state caratterizzate due diverse popolazioni di cellule Ly6C negative IA-IE positive e probabilmente corrispondono a cellule dendritiche. L'analisi e la strategia di gating delle cellule T hanno evidenziato la presenza della popolazione minore di cellule CD45 CD11b negative TCR beta positive.
Tra questi, circa 30-50 CD8 CD4 positivi e CD8 CD4 negativi per topo popolavano il plesso coroideo in condizioni fisiologiche. È importante controllare la qualità della perfusione poiché qualsiasi contaminazione del sangue può offuscare la composizione immunitaria del plesso coroideo. Questo metodo può essere seguito dall'ordinamento di popolazioni cellulari selezionate per ulteriori analisi come il sequenziamento dell'RNA di massa o a singola cellula.
