Questo protocollo confronta il carico di placca amiloide-beta in sezioni complete di interesse e sottoregioni di interesse nelle sezioni cerebrali di topi transgenici APP / PS1. Il metodo e i risultati presentati in questo particolare protocollo consentiranno ai lettori o ai ricercatori di scegliere tra l'analisi dell'intera regione di interesse o della sottoregione di interesse per determinare un carico beta nelle sezioni del cervello del topo. Per iniziare, scarica il software di analisi delle immagini.
Al momento dell'installazione, avviare il software e fare clic sul file, quindi aprire e scegliere l'immagine da analizzare. Dalla barra degli strumenti del software, selezionare l'utensile diritto e disegnare una linea retta lungo la lunghezza della barra della scala. Fare clic sull'analisi, quindi fare clic sulle schede imposta scala.
Ancora una volta, fai clic sull'analisi, quindi misura le schede per annotare la lunghezza o la distanza della barra della scala in pixel. Nella finestra popup, inserisci la distanza in pixel, la distanza nota della barra della scala e inserisci l'unità di lunghezza come micrometro. Quindi, selezionare la casella globale per applicare la nuova impostazione di scala a tutte le immagini seguenti, se vengono elaborate più immagini.
Fare clic su OK per applicare le impostazioni. Per impostare la misurazione desiderata sull'area della sezione, vai su Analizza, quindi imposta le misure e seleziona l'area e visualizza le caselle delle etichette. Assicurarsi che l'immagine analizzata sia selezionata nella scheda Reindirizza a.
Per facilitare la visualizzazione dell'ippocampo o della corteccia, vai all'immagine e regola la luminosità o il contrasto. Trascina gradualmente la barra di scorrimento massima verso sinistra per aumentare la chiarezza dei tessuti fino a quando le regioni cerebrali di interesse o ROI sono identificabili. Usa il poligono o lo strumento di selezione a mano libera per delineare la regione dell'ippocampo.
Una volta delineata la regione, fare clic sull'opzione di ripristino delle impostazioni di luminosità o contrasto per ripristinare la luminosità originale. Per misurare l'area totale del tessuto della regione selezionata, fare clic su modifica e cancellare all'esterno. Una volta che la regione selezionata è l'unica immagine sullo schermo, fare clic su Analizza, quindi misurare le schede per ottenere l'area totale del tessuto analizzata in una finestra popup.
Quindi, salvare i dati in un file Excel. Per misurare l'area positiva macchiata 6-E10, vai alle schede immagine, regolazione e soglia colore in ordine. Un filtro predefinito con il metodo di soglia fornisce i risultati desiderati evidenziando i segnali più forti in rosso.
Dopo aver selezionato la soglia appropriata, controlla lo sfondo scuro per evidenziare le macchie beta amiloidi su uno sfondo nero. Fare clic su seleziona, quindi originale e di nuovo selezionare, dando i segnali scuri dei depositi di beta amiloide su uno sfondo bianco. Quando viene generata la finestra popup, fare clic sulla scheda Analizza e analizza particelle e premere OK. Copia l'output di riepilogo generato dal software facendo clic sui pulsanti modifica e copia.
Quindi, incolla nel file Excel avviato in precedenza con le rispettive etichette. Calcola la percentuale di area positiva 6E-10 utilizzando la formula Dopo aver scaricato il software di analisi delle immagini, esegui i passaggi fino a quando il ROI del cervello non è identificabile, come dimostrato in precedenza. Quindi, utilizzando lo strumento rettangolo, selezionare il ROI nella corteccia o nell'ippocampo.
Nella barra degli strumenti, fai clic su modifica, quindi seleziona e specifica la scheda modificando l'altezza e la larghezza in un valore predefinito. Regolare la scatola in modo che sia interamente coperta dal tessuto. Ripristina la luminosità o il contrasto alla luminosità originale.
Duplica il ROI selezionato facendo clic con il pulsante destro del mouse sulla casella e facendo clic sul duplicato. Si aprirà una nuova finestra con la regione selezionata. Rinominare l'immagine duplicata per visualizzare l'area in cui si trova.
Regola il tipo di immagine duplicata utilizzando la barra degli strumenti e facendo clic sull'immagine, quindi digita i tasti a 8 bit per convertire l'immagine RGB duplicata in 8 bit, per analizzare al meglio le placche. Inverti l'immagine facendo clic su Modifica, quindi inverti. Per misurare l'area positiva 6E-10, vai all'immagine, quindi regola e soglia.
Un filtro predefinito sotto il metodo di soglia fornirà i risultati desiderati, evidenziando i segnali più forti in rosso. Dopo aver selezionato la soglia appropriata, premere applica. Per analizzare l'area positiva 6E-10, utilizzare la barra degli strumenti e fare clic sulle schede Analizza e analizza particelle, assicurandosi che i risultati riepilogativi siano controllati.
Copia l'output di riepilogo con l'area percentuale facendo clic sulle schede Modifica e copia. Quindi, incolla l'output di riepilogo nel file Excel avviato in precedenza con le rispettive etichette. Ripeti la procedura per le diverse regioni del tessuto, assicurandoti che il posizionamento di ogni scatola per delineare il ROI sia coerente tra ogni immagine.
In questa valutazione rappresentativa, vengono confrontati i metodi di analisi del ROI completo e secondario per quantificare l'area positiva 6E-10 nella corteccia e nei tessuti cerebrali dell'ippocampo. L'analisi completa del ROI comporta la delineazione dell'intero ROI. Al contrario, l'analisi del ROI secondario comporta la selezione di un'area predefinita all'interno del ROI.
La procedura graduale per la quantificazione dell'area positiva del ROI 6E-10 completo e secondario, con rotazione del ROI per la quantificazione del ROI secondario, è mostrata qui. La correlazione tra l'analisi completa e sub del ROI è dimostrata qui. Una significativa correlazione positiva è stata osservata tra l'area positiva 6E-10 riportata dai due lettori che eseguono l'analisi sub ROI per la corteccia e l'ippocampo.
Inoltre, l'area positiva media sub ROI 6E-10 condivideva una forte e significativa correlazione positiva con l'area ottenuta utilizzando il ROI completo. Per l'area media positiva 6E-10 dal pieno nelle analisi sub ROI, non è stata osservata alcuna differenza significativa nella corteccia e nell'ippocampo. Eliza ha osservato una correlazione significativa tra le misurazioni dell'omogeneizzato dell'intero cervello e dell'amiloide-beta 1-42 solubile, e l'analisi completa del ROI dallo studio La selezione della soglia è la chiave per ottenere una quantificazione accurata dei dati.
L'intervento dell'utente è necessario per garantire che le macchie positive siano accuratamente selezionate con il filtro selezionato. Oltre alla quantificazione dell'amiloide-beta, questo metodo può essere utilizzato per altre immunomacchia fluorescenti. Ad esempio, Iba-1, dalla quantificazione dell'area positiva microgliale.
