Questo protocollo estende il test molto comune della ferita da graffio utilizzato per gli studi di rigenerazione con monostrati derivati da enteroidi che rappresentano tutti i principali tipi di cellule dell'intestino tenue. Questa tecnica consente la visualizzazione in tempo reale della chiusura della ferita in un modello monostrato enteroide pretermine 2D di rigenerazione intestinale. La nostra tecnica può essere applicata allo studio dell'intestino dei mammiferi pretermine, che è tipicamente scarsamente modellato utilizzando linee cellulari di cancro colorettale trasformate.
Inizia scongelando 96 microlitri di matrice extracellulare, o BME idrogel a base di ECM, durante la notte sul ghiaccio da due a otto gradi Celsius. Diluire l'idrogel a base di ECM e il PBS ghiacciato senza calcio o magnesio in un rapporto di uno a 50. Rivestire ogni pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti con 200 microlitri di idrogel diluito a base di ECM ghiacciato e incubare la piastra rivestita per un minimo di un'ora a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.
Quindi aspirare il mezzo dalla piastra di coltura a 24 pozzetti contenente gli enteroidi 3D destinati ai monostrati e sostituirlo con 500 microlitri di reagente di dissociazione cellulare per pozzetto. Interrompere manualmente le cupole di idrogel basate su ECM pipettando su e giù da otto a 12 volte e trasferendo il contenuto di 12 pozzetti su un tubo conico da 15 millilitri. Lavare i 12 pozzetti vuoti con 250 microlitri di reagente di dissociazione cellulare per assicurarsi che tutti gli enteroidi siano stati rimossi e trasferire il contenuto in tubi conici da 15 millilitri.
Centrifugare i tubi conici a 300g per cinque minuti a quattro gradi Celsius ed eliminare il surnatante. Aggiungere 10 millilitri di tampone di lavaggio DMEM / F-12 ghiacciato ai tubi conici e sospendere i pellet enteroidi invertendo i tubi. Centrifugare a 300g per cinque minuti a quattro gradi Celsius e rimuovere il surnatante.
Risospendere i pellet cellulari in 12 millilitri di tripsina-EDTA a 37 gradi Celsius e posizionare i tubi in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 10 minuti o fino a quando le cellule appaiono solubili. Aggiungere tre millilitri di tampone di lavaggio DMEM / F-12 a ciascun tubo per diluire Trypsin-EDTA. Mescolare capovolgendo i tubi e metterli sul ghiaccio.
Filtrare gli enteroidi dissociati attraverso un filtro cellulare a maglie di 37 micrometri. Raccogliere il contenuto in tubi conici puliti da 15 millilitri e centrifugare i tubi a 300 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il surnatante dai tubi conici e risospendere i pellet cellulari con sei millilitri di HOMGY.
Quindi, rimuovere la piastra rivestita in idrogel a base di ECM dall'incubatore e aspirare qualsiasi soluzione di idrogel a base di ECM in eccesso senza graffiare la superficie rivestita o asciugare completamente la piastra. Aggiungere 500 microlitri della sospensione combinata di celle HOMGY da 12 millilitri in ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti rivestita con idrogel a base di ECM. Ruotare la piastra con il coperchio per garantire una distribuzione uniforme delle celle all'interno dei pozzetti.
Incubare la piastra a 37 gradi Celsius e 5% anidride carbonica, scambiando i mezzi HOMGY ogni due giorni fino a quando i monostrati raggiungono una confluenza superiore al 90%. Una volta che i monostrati raggiungono una confluenza superiore al 90%, aspirare il supporto per rimuovere eventuali celle che non riescono ad attaccarsi. Trattare le cellule con 500 microlitri di HA35 o PBS sciolti in HOMGY per 24 ore.
Successivamente, rimuovere il supporto senza interrompere la superficie del monostrato. Utilizzando una punta per pipetta da 200 microlitri, effettuare un graffio lineare su tutto il diametro superficiale del monostrato in ciascun pozzetto, facendo attenzione a non lasciare asciugare i monostrati. Lavare i monostrati graffiati una volta con 500 microlitri di 1X PBS e aggiungere 500 microlitri di HA35 o PBS sciolti in HOMGY.
Trasferire la piastra allo strumento di analisi delle cellule vive all'interno di un incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Sotto l'icona Schedule nel software di analisi delle celle live, fare clic sull'icona Launch Add New Vessel Wizard. Selezionare Scan on Schedule (Scansione in base alla pianificazione), quindi fare clic su Avanti.
Selezionare Nuovo in Crea nave e fare clic su Avanti, quindi selezionare Pozzo intero in Tipo di scansione e fare clic su Avanti. Scegliete Fase per i canali immagine e 4x per l'obiettivo. Selezionare il produttore della targhetta e il numero di catalogo dall'elenco fornito e fare clic su Avanti.
Selezionare una posizione vuota del recipiente seguita dal modello di scansione desiderato. Inserisci il nome della targa in Nome, quindi seleziona più per creare un layout di targa. Selezionare piccolo più per creare un nome di trattamento.
Immettere il nome breve e quindi OK. Evidenziare i pozzetti a piastre corrispondenti a quel trattamento e colpire il grande plus per designare i pozzi con quel trattamento. Immettere la concentrazione del composto e fare clic su OK. Al termine della piastra, selezionare OK, Avanti (Next). Selezionare Posticipa analisi fino a un secondo momento, quindi Crea nuova pianificazione con scansioni a intervalli di quattro ore.
Interrompere la scansione a un giorno, zero ore. Assicurarsi che il riepilogo sia corretto e quindi aggiungere alla pianificazione. Nel software di analisi delle cellule live, selezionare Visualizza nella parte superiore dello schermo.
Dal menu Nome nave, passare alla scansione completata di 24 ore e fare doppio clic sul nome dell'imbarcazione. Seleziona l'icona Esporta immagini e filmati a sinistra seguita dall'opzione Come visualizzato. Evidenziare i pozzi di interesse, quindi selezionare i punti temporali di interesse e la serie di immagini visualizzate.
Assicurarsi che il tipo di sequenza e le scansioni siano corretti. Selezionare il percorso della cartella di destinazione desiderato. Scegli JPEG dal menu a discesa, quindi Esporta.
Apri il software ImageJ e carica l'immagine del saggio della ferita da graffio. Selezionare Immagine, quindi digitare 8 bit per modificare l'immagine da RGB a 24 bit. Selezionare Plugin, Macros, Install, Wound_healing_size plugin per installare il plugin Wound Healing Size.
Successivamente, imposta il raggio della finestra di varianza su 20, il valore di soglia su 100, la percentuale di pixel saturi su 0,001. Sì per Imposta scala globale e quindi fare clic su OK. Verificare che l'area delineata sia l'area della ferita e ripetere l'operazione per ulteriori graffi. Infine, calcola la percentuale di guarigione della ferita dell'area del graffio delle cellule in migrazione o proliferazione nell'arco di 24 ore utilizzando l'equazione mostrata sullo schermo.
Qui, T0 è l'area al tempo zero ore e TC è l'area a zero ore, quattro ore, 12 ore o 24 ore. La generazione di enteroidi e la procedura di analisi della guarigione delle ferite monostrato derivata da enteroidi sono mostrate in queste immagini. Una coltura di enteroidi intestinali tridimensionali e non umani dei primati viene utilizzata per dissociarsi in monostrati bidimensionali.
I monostrati sono stati coltivati a una confluenza superiore al 90% in una piastra a 24 pozzetti e quindi trattati con HA35 o PBS per 24 ore. I monostrati sono stati quindi graffiati con una punta per pipetta P200. Di seguito sono mostrate le immagini rappresentative di HA35 nei trattamenti di controllo di monostrati enteroidi di primati non umani.
Le immagini sono state ottenute a zero ore, quattro ore, 12 ore e 24 ore dopo aver eseguito un graffio con una punta di pipetta P200. L'effetto di HA35 sui monostrati andoidi di guarigione delle ferite è mostrato qui. Il cambiamento nella guarigione delle ferite nel tempo nei monostrati enteroidi dipende dalla concentrazione del trattamento HA35.
HA35 ha aumentato significativamente la guarigione delle ferite dopo quattro ore e 12 ore a 100 microgrammi per millilitro e 200 microgrammi per millilitro rispetto al controllo, ma i tassi di guarigione convergevano tra i trattamenti di 24 ore. Una delle cose più importanti da ricordare con questa procedura è che i monostrati enteroidi intestinali sono di breve durata. Quindi, una volta che sono al 90% confluidi, gli investigatori dovrebbero cercare di usarli rapidamente.
Questa tecnica è diventata il nostro modello di riferimento per la rigenerazione intestinale pretermine in vitro, soprattutto se siamo interessati a lesioni più meccaniche piuttosto che infiammatorie.
