Questo protocollo consente una comoda fabbricazione di microgel di chitosano senza solventi tossici che possono essere utilizzati per una varietà di applicazioni di ingegneria tissutale e somministrazione di farmaci. Questa tecnica non richiede attrezzature o formazione speciali e non richiede tecniche di emulsione tossica o risciacqui con solvente, rendendola altamente biocompatibile e traducibile in un ambiente clinico. Abbiamo applicato questa tecnica come strategia di biomateriale per il trattamento delle lesioni della piastra di crescita.
Tuttavia, riteniamo che questa tecnica sarà utile anche in altre applicazioni di medicina rigenerativa. Questa tecnica può essere applicata ad altre applicazioni di medicina rigenerativa che trarrebbero beneficio da un sistema di scaffold biomateriale iniettabile, biodegradabile, con il potenziale per un rilascio prolungato di farmaci. Inizia aggiungendo acido acetico e chitosano purificato a una siringa Luer lock da 10 millilitri per formare una soluzione di chitosano del 6% peso per volume.
Utilizzando un connettore Luer lock femmina femmina, collegare due siringhe Luer lock, quindi mescolare la soluzione avanti e indietro fino a quando il chitosano in è completamente disciolto nell'acido ascetico. Ora aggiungere 100 microlitri della soluzione di genipina alla siringa contenente chitosano e mescolare avanti e indietro tra le siringhe per 30 secondi, quindi espellere la miscela dalla siringa su una capsula di Petri da 35 millimetri. Coprire la capsula di Petri con pellicola di paraffina e incubarla a 37 gradi Celsius durante la notte in un'atmosfera umidificata.
Utilizzare una spatola per rompere l'idrogel in pezzi più piccoli, quindi posizionare un filtro della dimensione della maglia desiderata nella parte posteriore di una siringa pulita da 10 millilitri. Trasferire i pezzi di gel rotti nella siringa dotata del filtro e aggiungere 6 millilitri di acqua doppia distillata. Collegare la siringa tramite un connettore Luer lock a un'altra siringa pulita da 10 millimetri.
Forzare la miscela di gel e acqua attraverso la siringa con il filtro per creare microgel. Dopo la prima filtrazione, aprire la siringa contenente il filtro e aggiungere nuovamente la miscela in questa siringa. Forzare nuovamente la miscela attraverso il filtro.
Ora, trasferire la miscela di gel filtrato in un tubo conico da 50 millilitri e aggiungere acqua doppia distillata per portare il volume a 20 millilitri. Vortice la soluzione per ottenere una soluzione omogenea. Centrifugare i microgel a 100 volte g per 5 minuti a temperatura ambiente.
Dopo la centrifugazione, rimuovere la fase acquosa superiore e risospese i microgel in 10 millilitri di etanolo al 70%, quindi vorticare i microgel e metterli sotto la luce UV per un'ora per sterilizzare. Ora, centrifuga i microgel a 1000 volte g per 5 minuti a temperatura ambiente. Scartare l'etanolo e risciacquare 3 volte con acqua doppia distillata.
Sospendere i pellet di microgel in un volume uguale di acqua doppia distillata. Con l'aumento del pH, i microgel hanno mostrato una diminuzione del gonfiore come descritto dal cambiamento del diametro di Feret. Inoltre, la dimensione delle particelle di microgel dipende dalla dimensione dei pori del filtro utilizzato.
La maglia numero 200 ha prodotto piccole particelle, mentre la maglia numero 100 ha dato origine a particelle grandi. La presenza di microgel nel sito ferito ha promosso la rigenerazione della cartilagine. La colorazione dell'ematossilina blu di Alcian ha dimostrato che i microgel iniettati nel tessuto danneggiato hanno impedito la formazione precoce di barre ossee e microgel caricati con agenti bioattivi SDF-1a e TGF-B3 hanno promosso la formazione di cartilagine.
È importante assicurarsi che il filtro della rete metallica sia posizionato correttamente nella siringa in modo che possa avvenire un filtraggio efficace. È anche importante ripetere la filtrazione alcune volte per garantire una distribuzione omogenea delle dimensioni del microgel. Questi microgel possono essere applicati a un'ampia varietà di applicazioni di ingegneria tissutale che richiedono un substrato di scaffold biomateriale che ha il potenziale per un rilascio prolungato di terapie.
