La trifosforilazione è una modifica onnipresente di 5'RNA in biologia ed è sempre più utilizzata nelle applicazioni biotecnologiche. Il protocollo qui delineato consente la trifosforilazione 5'di qualsiasi oligonucleotide preparato mediante sintesi automatizzata standard. La trifosforilazione chimica agisce su oligonucleotidi contenenti RNA, DNA o acido nucleico non naturale.
Qui, l'L-RNA mancino trifosforilato, l'enantiomero del D-RNA biologico, viene sintetizzato purificato e utilizzato in una reazione ribosomica. La trifosforilazione viene eseguita dopo sintesi automatizzata di oligonucleotidi e prima della deprotezione. Questi passaggi non sono mostrati qui, ma i ricercatori dovrebbero avere familiarità con i metodi standard per entrambi.
Per iniziare, assicurarsi che lo spazio di lavoro per la fosforilazione abbia un collettore di gas con almeno due linee e il gorgogliatore collegato a una sorgente di argon secco con pressione regolabile poiché la reazione di trifosforilazione deve essere eseguita sotto argon. Quindi collegare una siringa di plastica da un millilitro alle linee per facilitare il collegamento all'apparato di reazione. Quindi, raccogliere l'attrezzatura tra cui siringhe di plastica da un millilitro, un rubinetto di polipropilene a tre vie, aghi noncoranti, tubi in polipropilene da 1,5 millilitri, una piccola spatola metallica e conservarli in un contenitore o essiccatore sigillato con un dessicante a temperatura ambiente per almeno un giorno prima dell'uso.
Sotto pressione di argon, prelevare 30 millilitri di 1, 4-diossano anidro da una bottiglia sigillata. Trasferire in una bottiglia di vetro essiccata da 30 millilitri e aggiungere una trappola per l'essiccazione. Sigillare con setti di gomma e conservare in un essiccatore con dessicant.
Allo stesso modo, preparare 30 millilitri di N, N-dimetilformammide, acetonitrile e la miscela di tre parti di diossano e una parte di piridina in volume. Preparare la soluzione di TBAP mescolando il pirofosfato solido di tribilammonio con dimetilformammide e tributilamina in una bottiglia di vetro da 30 millilitri come descritto nel manoscritto. Aggiungete tre trap di disegno.
Sigillare la bottiglia con un setto di gomma sotto argon e bollare con argon per 30 minuti. Dopo aver preparato un oligonucleotide con un idrossile libero di 5'su una colonna di sintesi utilizzando un sintetizzatore automatico DNA/RNA. Preparare la camera rimuovendo lo stantuffo da una siringa asciutta da un millilitro.
Tagliare la parte superiore della siringa con le forbici o una lama di rasoio e attaccare la siringa alla colonna di sintesi. Nella parte superiore della siringa, collegare il rubinetto a tre vie e collegare l'ingresso laterale del rubinetto alla sorgente di argon secco con il gorgogliatore in modo che l'ingresso superiore del rubinetto funga da porta di iniezione del reagente. Fissare questi operatori a un supporto con morsetti e sigillare tutti i giunti a monte con pellicola sigillante a cera.
Quindi regolare il rubinetto in modo che la porta di iniezione sia chiusa e l'apparecchio sia aperto alla sorgente di argon. Chiudere il gorgogliatore e lasciare che l'argon a bassa pressione fluisca attraverso la camera d'azione per cinque minuti. Dopo aver riaperto il gorgogliatore, attaccare una siringa sul fondo della colonna di sintesi, che sarà la siringa di scarto.
Quindi, tirare l'argon attraverso la colonna ripetutamente usando la siringa di scarto e quindi riattaccare la siringa con lo stantuffo spinto completamente dentro. Per aggiungere un reagente o un solvente, attaccare un ago alla fonte di argon secco e inserirlo nel setto del reagente o del flacone di solvente, facendo attenzione a non immergere l'ago nel contenuto del flacone. Quindi assemblare una siringa asciutta con un ago e inserirla nel setto del reagente o del flacone di solvente senza immergerlo nel contenuto del flacone.
Successivamente, riempire la siringa con argon, estrarre l'ago dal setto ed espellere l'argon. Dopo aver riempito la siringa con argon ed espulso ancora una volta, riempire la siringa con il volume richiesto di solvente o reagente sotto pressione di argon. Regolare il rubinetto in modo che la sorgente di argon sia chiusa e la porta di iniezione sia aperta.
Una volta regolato rapidamente l'arresto dell'apparecchio, rimuovere la siringa e l'ago riempiti dal flacone di origine, asciugare il solvente attaccato al lato o alla punta dell'ago e quindi inserire l'ago nella porta di iniezione. Dopo aver espulso un reagente nell'anticamera degli operatori, rimuovere l'ago e chiudere la porta di iniezione riaprendo l'apparecchio alla fonte di argon. Aspirare delicatamente il liquido dall'anticamera attraverso la colonna di sintesi utilizzando la siringa di scarto in modo che tutto il liquido sia ora trattenuto nella siringa di scarto.
Ora spingere lentamente la soluzione verso l'alto nella colonna di sintesi, assicurandosi che non ci siano bolle di gas nella colonna. Per mescolare o agitare, tirare delicatamente la soluzione su e giù sopra la colonna con la siringa di scarto. Per rimuovere un reagente o un solvente dalla colonna, estrarre lentamente la soluzione nella siringa di scarto.
Dopo che la maggior parte della soluzione è passata nella siringa di scarto, estrarre l'argon per lavare il solvente rimanente dalla colonna. Quindi, rimuovere il film sigillante in cera attorno al giunto della siringa di scarto. Quindi rimuovere la siringa ed eliminare la soluzione di scarto.
Successivamente, sostituire la siringa di scarto con una nuova siringa asciutta e richiudere l'articolazione. Dopo aver assemblato l'apparato di trifosforilazione, iniziare la reazione di trifosforilazione aggiungendo 200 microlitri di piridina diossano all'anticamera come dimostrato in precedenza. Ma non tirare ancora il campione sulla colonna di sintesi.
Dopo aver sciolto SalPCl in diossano come descritto nel manoscritto, aggiungerlo all'anticamera e caricarlo sulla colonna di sintesi usando una siringa asciutta. Quindi lasciare reagire per 15 minuti e quindi rimuovere e scartare la soluzione SalPCl utilizzando una siringa di scarto come dimostrato in precedenza. Immediatamente dopo aver rimosso la soluzione SalPCl, aggiungere 250 microlitri di soluzione TBAP all'anticamera e caricarli sulla colonna di sintesi.
Lasciare che reagisca 20 minuti con agitazione e scartare come descritto in precedenza. Successivamente, lavare la colonna con 0,5 millilitri di N, N-dimetilformammide, quindi 0,5 millilitri di acetonitrile, rimuovendo il solvente dopo ogni aggiunta. Dopo aver aggiunto la soluzione ossidante, rimuoverla e lavare nuovamente la colonna con acetonitrile utilizzando la stessa procedura mostrata, smontare l'apparecchio e lavare la colonna con cinque millilitri di acetonitrile.
Successivamente, asciugare la colonna. Scindere l'oligonucleotide trifosforilato dal supporto solido e deproteggere usando protocolli standard come descritto nel manoscritto. Successivamente, sciogliere l'oligonucleotide deprotetto essiccato nel tampone di carico dell'urea, riscaldato a 80 gradi Celsius, quindi caricare su un gel di poliacrilammide e funzionare per una o due ore a 25-35 watt.
Alla fine dell'elettroforesi su gel, dopo aver rimosso la piastra gel, smontarla e avvolgere il gel in un film di polivinilcloruro. Quindi, identificare le bande di prodotto mediante back shadowing con luce UV a 254 nanometri ed asportare la banda principale del prodotto utilizzando una lama di rasoio. Schiacciare il gel asportato estrudendolo attraverso una siringa di plastica o meccanicamente.
Per oligonucleotidi inferiori a 15 nucleotidi, eluire in tre volte il volume di gel di acqua priva di nucleasi per almeno 12 ore con agitazione o agitazione. Quindi rimuovere i pezzi di gel solido facendo passare la soluzione attraverso una siringa dotata di un filtro da 0,2 micrometri e concentrare mediante liofilizzazione. Dopo la concentrazione, rimuovere i sali residui e i saluti utilizzando una colonna di esclusione delle dimensioni usa e getta e concentrare per liofilizzazione come dimostrato in precedenza.
Dopo aver preparato 10 microlitri di una soluzione di RNA contenente polimerasi ribozima e modello di primer L-RNA e trinucleotidi trifosfati come descritto nel manoscritto, ricotturandolo a 90 gradi Celsius per un minuto e raffreddandolo a 23 gradi Celsius a 0,2 gradi Celsius al secondo in un termociclatore PCR. Dopo aver incubato la soluzione di RNA a 17 gradi Celsius, interrompere la reazione aggiungendo 10 microlitri del doppio della concentrazione del tampone di avvio mentre la reazione procede, prendere 10 aliquote di microlitri e spegnere con cinque microlitri di 0,5 MOLARE EDTA a pH 8 ed elaborare ogni campione per isolare l'RNA come descritto nel manoscritto. Sciogliere l'RNA precipitato in 10 microlitri di tampone di carico del gel formalizzato e preparare il primer etichettato come descritto nel testo.
Una volta preparati i campioni, riscaldare a 80 gradi Celsius. Caricare cinque microlitri del campione in ciascun pozzetto ed eseguire il gel a 40 watt per circa 40 minuti. Dopo aver rimosso la piastra gel dal supporto, eseguire la scansione utilizzando uno scanner gel fluorescente o fosforescente per visualizzare i prodotti di estensione L-RNA chirale incrociati.
Dopo la purificazione del gel, l'ombreggiatura posteriore UV rivela la presenza di 5'trifosfato come singolo prodotto principale, come mostrato per i trimeri di DNA AAA e CCC e il trimero GAA L-RNA. Il prodotto lato 5'idrossile è spesso visibile come una banda di migrazione più lenta, che è stata isolata e identificata dalla spettrometria di massa per i trimeri del DNA. Bande aggiuntive durante la purificazione del gel sono correlate con i prodotti collaterali 5'difosfato, monofosfato e H-fosfonato nella spettrometria di massa dei prodotti di reazione non purificati.
I prodotti 5'trifosfati mostrano un picco di massa primario corrispondente al 5'trifosfato insieme alle masse 5'di e monofosfato. I trinucleotidi L-RNA correlati chimicamente trifosfati sono stati utilizzati con un primer L-RNA e un modello L-RNA in una reazione di polimerizzazione dell'RNA analizzata da PAGE e riprodotta utilizzando uno scanner gel fluorescente. Il prodotto esteso contrassegnato da cerchi neri ha dimostrato la sintesi di una versione L-RNA del ribozima a testa di martello codificato dal modello.
L'esposizione all'acqua durante la trifosforilazione ridurrà la resa. Seguire i passaggi per preparare i reagenti secchi e assemblare attentamente l'apparato di reazione. Spostare lentamente i fluidi attraverso l'apparecchio per evitare la rottura delle guarnizioni.
La trifosforilazione chimica è essenziale per la preparazione di trifosfati oligonucleotidici non biologici, incluso l'RNA mancino. Ciò ha permesso la sintesi incrociata di ribozima chirale delle versioni speculari delle molecole di RNA presenti in biologia.
