Triphosphorylation은 생물학에서 RNA의 유비쿼터스 5' 변형이며 생명 공학 응용 분야에서 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 여기에 요약된 프로토콜은 표준 자동 합성에 의해 제조된 임의의 올리고뉴클레오티드의 5'트리포스포릴화를 가능하게 한다. 화학적 트리포스포릴화는 RNA, DNA 또는 비천연 핵산을 포함하는 올리고뉴클레오티드에 작용한다.
여기서, 생물학적 D-RNA의 거울상이성질체인 트리인산화된 왼손잡이 L-RNA는 정제되어 합성되어 리보솜 반응에 사용된다. 트리포스포릴화는 자동화된 올리고뉴클레오티드 합성 후 및 탈보호 전에 수행된다. 이 단계는 여기에 나와 있지 않지만 연구원은 두 가지 모두에 대한 표준 방법에 익숙해야합니다.
시작하려면 인산화를 위한 작업 공간에 적어도 두 개의 라인이 있는 가스 매니폴드가 있고 트리포스포릴화 반응이 아르곤 하에서 수행되어야 하므로 조절 가능한 압력으로 건조 아르곤 소스에 연결된 버블러가 있는지 확인하십시오. 그런 다음 한 밀리리터의 플라스틱 주사기를 라인에 부착하여 반응 장치와의 연결을 용이하게합니다. 다음으로, 1 밀리리터 플라스틱 주사기, 3 방향 폴리프로필렌 스토콕, 비코링 바늘, 1.5 밀리리터 폴리프로필렌 튜브, 작은 금속 주걱을 포함하는 장비를 수집하고, 사용 전에 적어도 하루 동안 실온에서 건조제와 함께 밀봉된 용기 또는 데시케이터에 보관한다.
아르곤 압력 하에서 밀폐 된 병에서 무수 1, 4- 다이옥산 30 밀리리터를 인출하십시오. 말린 30 밀리리터 유리 병에 옮기고 건조 트랩을 추가하십시오. 고무 셉타로 밀봉하고 건조제가있는 데시케이터에 보관하십시오.
유사하게, 30 밀리리터의 N,N-디메틸포름아미드, 아세토니트릴, 및 3부 디옥산 및 한 부분 피리딘의 혼합물을 부피별로 준비한다. 원고에 기재된 바와 같이 고체 트리부틸암모늄 피로포스페이트와 디메틸포름아미드 및 트리부틸아민을 30밀리리터 유리 병에 혼합하여 TBAP 용액을 제조하였다. 세 개의 드로잉 트랩을 추가합니다.
병을 아르곤 아래의 고무 격막으로 밀봉하고 아르곤으로 거품을 30 분 동안 밀봉하십시오. 자동화 된 DNA/RNA 합성기를 사용하여 합성 컬럼 상에서 유리 5'히드록실을 갖는 올리고뉴클레오티드를 준비한 후. 건조된 한 밀리리터 주사기로부터 플런저를 제거하여 챔버를 준비한다.
가위 또는 면도날을 사용하여 주사기 상단을 자르고 주사기를 합성 컬럼에 부착하십시오. 주사기의 상단에 세 방향 스톱콕을 부착하고 스톱콕의 측면 입구를 버블러가있는 건조 아르곤 소스에 부착하여 스톱콕의 상단 입구가 시약 주입 포트 역할을하도록하십시오. 이 작업자를 클램프가 있는 스탠드에 고정하고 왁스 씰링 필름으로 모든 업스트림 조인트를 밀봉합니다.
그런 다음 주입 포트가 닫히고 장치가 아르곤 소스에 개방되도록 스톱콕을 조정하십시오. 버블러를 닫고 저압에서 아르곤이 다섯 분 동안 작용 챔버를 통해 흐르게하십시오. 버블러를 다시 연 후, 주사기를 폐기물 주사기가 될 합성 컬럼의 바닥에 부착하십시오.
다음으로, 폐기물 주사기를 사용하여 컬럼을 통해 아르곤을 반복적으로 당긴 다음 플런저가 완전히 밀어 넣어 주사기를 다시 부착하십시오. 시약 또는 용매를 추가하려면 바늘을 건조 아르곤 소스에 부착하고 시약 또는 용매 병 중격에 넣고 바늘을 병 내용물에 담그지 않도록주의하십시오. 그런 다음 바늘로 건조한 주사기를 조립하고 병 내용물에 담그지 않고 시약 또는 용매 병 격막에 삽입하십시오.
그런 다음 주사기를 아르곤으로 채우고 중격에서 바늘을 꺼내 아르곤을 배출하십시오. 주사기를 아르곤으로 채우고 한 번 더 배출 한 후 아르곤 압력 하에서 필요한 부피의 용매 또는 시약으로 주사기를 채 웁니다. 아르곤 소스가 닫히고 주입 포트가 열리도록 스톱콕을 조정하십시오.
장치의 정지가 신속하게 조정되면 채워진 주사기 및 바늘을 소스 병에서 제거하고 바늘의 측면 또는 팁에 달라 붙은 용매를 닦아 낸 다음 바늘을 주사 포트에 삽입하십시오. 시약을 작업자의 안티 챔버 내로 배출 한 다음 바늘을 제거하고 장치를 아르곤 소스로 다시 열면서 주입구를 닫습니다. 폐기물 주사기를 사용하여 합성 컬럼을 통해 안티 챔버로부터 액체를 부드럽게 끌어당겨 모든 액체가 이제 폐주사기 내에 유지되도록 한다.
이제 천천히 용액을 합성 컬럼으로 밀어 넣어 컬럼에 가스 버블이 없도록 합니다. 혼합하거나 교반하려면 폐주사기로 용액을 컬럼 위로 부드럽게 위아래로 당깁니다. 컬럼에서 시약 또는 용매를 제거하려면 용액을 폐주사기로 천천히 당깁니다.
용액의 벌크가 폐주사기 내로 통과된 후, 아르곤을 통해 당겨 컬럼으로부터 잔여 용매를 플러시한다. 다음으로, 폐주사기 접합부 주위의 왁스 밀봉 필름을 제거한다. 그런 다음 주사기를 제거하고 폐기물을 버리십시오.
그런 다음 폐주사기를 새로운 건조 주사기로 교체하고 관절을 다시 밀봉하십시오. 트리포스포릴화 장치를 조립한 후, 이전에 입증된 바와 같이 200 마이크로리터의 피리딘 디옥산을 항-챔버에 첨가함으로써 트리포스포릴화 반응을 시작한다. 그러나 아직 샘플을 합성 컬럼으로 끌어 당기지 마십시오.
원고에 기재된 바와 같이 SalPCl을 다이옥산에 용해시킨 후, 이를 항-챔버에 첨가하고, 건조 주사기를 사용하여 합성 컬럼 상에 로딩한다. 그런 다음 15분 동안 반응시킨 다음 이전에 입증된 바와 같이 폐주사기를 사용하여 SalPCl 용액을 제거 및 폐기한다. SalPCl 용액을 제거한 직후, 250 마이크로리터의 TBAP 용액을 안티챔버에 첨가하고, 합성 컬럼 상에 로딩한다.
앞에서 설명한 것처럼 동요와 함께 20 분 동안 반응시키고 버리십시오. 그 후, 컬럼을 0.5 밀리리터의 N,N-디메틸포름아미드로 세척한 다음, 0.5 밀리리터의 아세토니트릴로 세척하고, 각각의 첨가 후에 용매를 제거하였다. 산화제 용액을 첨가 한 후, 그것을 제거하고 표시된 동일한 절차를 사용하여 다시 아세토니트릴로 컬럼을 세척하고, 장치를 분해하고 다섯 밀리리터의 아세토니트릴로 컬럼을 세척한다.
그런 다음 기둥을 말립니다. 트리포스포릴화된 올리고뉴클레오티드를 고체 지지체로부터 절단하고, 원고에 기재된 바와 같은 표준 프로토콜을 사용하여 탈보호한다. 다음으로, 건조된 탈보호 올리고뉴클레오티드를 우레아 로딩 완충액에 용해시키고, 섭씨 80도로 가열한 다음, 폴리아크릴아미드 겔 상에 로딩하고, 25 내지 35와트에서 일-2시간 동안 실행한다.
겔 전기영동이 끝나면 겔 플레이트를 제거한 후 분해하고 겔을 폴리 염화 비닐 필름으로 감쌉니다. 다음으로, 254 나노미터 자외선으로 백섀도잉하여 제품 밴드를 식별하고 면도날을 사용하여 주요 제품 밴드를 소비한다. 적출된 겔을 플라스틱 주사기를 통해 또는 기계적으로 압출하여 분쇄한다.
15 뉴클레오티드보다 짧은 올리고뉴클레오티드의 경우, 교반 또는 진탕으로 적어도 12시간 동안 뉴클레아제 유리 물의 겔 부피의 3배에서 용출시킨다. 그런 다음 용액을 0.2 마이크로미터 필터가 장착된 주사기를 통해 통과시켜 고체 겔 조각을 제거하고 동결건조하여 농축시킨다. 농축 후, 일회용 크기 배제 컬럼을 사용하여 잔류 염 및 경례를 제거하고 앞서 입증된 바와 같이 동결건조에 의해 농축한다.
원고에 기재된 중합효소 리보자임 및 L-RNA 프라이머 주형 및 트리포스페이트 트리뉴클레오티드를 함유하는 RNA 용액 10 마이크로리터를 제조한 후, 이를 1분 동안 섭씨 90도까지 가열하고 PCR 열순환기에서 초당 섭씨 0.2도에서 섭씨 23도까지 냉각하여 어닐링한다. RNA 용액을 섭씨 17도에서 인큐베이션한 후, 반응이 진행됨에 따라 시작 완충액의 두 배 농도의 10 마이크로리터를 첨가하여 반응을 중지시키고, 10 마이크로리터 분취량을 취하고, pH 8에서 0.5몰 EDTA의 5마이크로리터로 켄칭하고, 원고에 기재된 바와 같이 RNA를 분리하기 위해 각 샘플을 처리한다. 침전된 RNA를 10 마이크로리터의 정형화된 겔 로딩 완충액에 용해시키고, 텍스트에 기재된 바와 같이 미반응 말단 표지된 프라이머를 제조하였다.
샘플이 준비되면 섭씨 80도까지 가열하십시오. 각 웰에 다섯 마이크로 리터의 샘플을 로딩하고 약 40 분 동안 40 와트에서 겔을 실행하십시오. 스탠드로부터 겔 플레이트를 제거한 후, 형광 또는 인광 겔 스캐너를 사용하여 스캔하여 교차 키랄 L-RNA 연장 생성물을 시각화한다.
겔 정제 후, UV 백 섀도잉은 AAA 및 CCC DNA 삼량체 및 GAA L-RNA 삼량체에 대해 나타낸 바와 같이 단일 주요 생성물로서 5'트리포스페이트의 존재를 드러낸다. 5'히드록실 측 생성물은 종종 더 느린 이동 밴드로 보이며, 이는 DNA 삼량체에 대한 질량 분광법에 의해 분리되고 확인되었다. 겔 정제 동안 추가의 밴드는 정제되지 않은 반응 생성물의 질량 분광분석에서 5'디포스페이트, 모노포스페이트, 및 H-포스포네이트 부생성물과 상관관계가 있다.
5' 트리포스페이트 생성물은 5' 디포스페이트 및 모노포스페이트 질량과 함께 5'트리포스페이트에 상응하는 일차 질량 피크를 나타낸다. 화학적으로 트리포스페이트 관련 L-RNA 트리뉴클레오티드를 RNA 중합 반응에서 L-RNA 프라이머 및 L-RNA 주형과 함께 사용하여 PAGE로 분석하고 형광 겔 스캐너를 사용하여 영상화하였다. 검은 원으로 표시된 확장 된 생성물은 템플릿에 의해 인코딩 된 해머 헤드 리보자임의 L-RNA 버전의 합성을 입증했습니다.
트리인산화 동안 물에 노출되면 수율이 감소합니다. 건조 시약을 준비하고 반응 장치를 조심스럽게 조립하는 단계를 따르십시오. 씰이 깨지지 않도록 장치를 통해 유체를 천천히 이동하십시오.
화학적 트리포스포릴화는 왼손잡이 RNA를 포함한 비생물학적 올리고뉴클레오티드 트리포스페이트를 제조하는데 필수적이다. 이것은 생물학에서 발견되는 RNA 분자의 거울 이미지 버전의 교차 키랄 리보자임 합성을 가능하게 했다.
