三リン酸化は、生物学におけるRNAの遍在的な5'修飾であり、バイオテクノロジー用途でますます使用されている。ここで概説するプロトコールは、標準的な自動合成によって調製された任意のオリゴヌクレオチドの5'トリリン酸化を可能にする。化学的三リン酸化は、RNA、DNA、または非天然核酸を含むオリゴヌクレオチドで作用する。
ここで、生体D-RNAの鏡像異性体であるトリリン酸化左巻きL-RNAは、合成精製され、リボソーム反応に用いられる。トリリン酸化は、自動オリゴヌクレオチド合成後および脱保護前に行われる。これらの手順はここでは示されていませんが、研究者は両方の標準的な方法に精通している必要があります。
まず、リン酸化のためのワークスペースに少なくとも2本のラインを備えたガスマニホールドがあり、三リン酸化反応はアルゴン下で実行する必要があるため、調整可能な圧力で乾燥アルゴン源に接続されたバブラーがあることを確認してください。次に、1ミリリットルのプラスチックシリンジをラインに取り付けて、反応装置への接続を容易にします。次に、1ミリリットルのプラスチックシリンジ、三方ポリプロピレン活栓、ノンコアリングニードル、1.5ミリリットルのポリプロピレンチューブ、小さな金属ヘラを含む機器を集め、使用前に少なくとも1日間、室温で乾燥剤を入れた密閉容器またはデシケータに保管してください。
アルゴン圧下で、密閉ボトルから30ミリリットルの無水1,4-ジオキサンを抜き取る。乾燥した30ミリリットルのガラス瓶に移し、乾燥トラップを加える。ゴムセプタでシールし、乾燥剤と一緒にデシケーターに保管してください。
同様に、30ミリリットルのN,N−ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、ジオキサン3部およびピリジン1部の混合物を体積基準で調製する。原稿に記載されているように、固体トリブチルアンモニウムピロホスフェートとジメチルホルムアミドおよびトリブチルアミンを30ミリリットルのガラス瓶に入れて混合してTBAP溶液を調製する。3 つの描画トラップを追加します。
アルゴンの下にゴム製の隔壁でボトルを密封し、アルゴンで30分間泡立てます。DNA/RNA自動合成機を用いて合成カラム上で遊離の5'ヒドロキシルを有するオリゴヌクレオチドを調製した後。乾燥した1ミリリットルのシリンジからプランジャーを取り外してチャンバーを準備します。
はさみまたはカミソリの刃でシリンジの上部を切り取り、シリンジを合成カラムに取り付けます。シリンジの上部に、三方活栓を取り付け、活栓の上部入口が試薬注入口として機能するように、活栓の側面入口をバブラーで乾燥アルゴン源に取り付けます。このオペレータをクランプ付きのスタンドに固定し、すべての上流ジョイントをワックスシーリングフィルムでシールします。
次に、注入口が閉じられ、装置がアルゴン源に対して開かれるように活栓を調整します。バブラーを閉じ、低圧のアルゴンがアクションチャンバ内を5分間流れるようにします。バブラーを再度開いた後、合成カラムの底部にシリンジを取り付けます。
次に、廃シリンジを使用してアルゴンをカラムに繰り返し引き出し、プランジャーを完全に押し込んだ状態でシリンジを取り付け直します。試薬または溶媒を添加するには、針を乾燥アルゴン源に取り付け、試薬または溶媒ボトルの隔壁に挿入し、針をボトルの内容物に浸さないように注意してください。次に、針で乾いたシリンジを組み立て、ボトルの内容物に浸さずに試薬または溶媒ボトルセプタムに挿入します。
その後、注射器をアルゴンで満たし、中隔から針を抜き、アルゴンを排出する。シリンジにアルゴンを充填し、もう一度排出した後、アルゴン圧力下でシリンジに必要な量の溶媒または試薬を充填する。アルゴン源が閉じ、注入ポートが開くように活栓を調整します。
装置の停止が迅速に調整されたら、充填されたシリンジと針をソースボトルから取り外し、針の側面または先端に付着した溶媒を拭き取ってから、針を注射口に挿入します。続いて試薬をオペレータの抗チャンバーに排出し、針を取り外し、アルゴン源に装置を再度開放しながら注入口を閉じた。すべての液体が廃棄物シリンジに保持されるように、廃液シリンジを使用して、抗チャンバから合成カラムを通って液体を静かに引き出します。
次に、溶液をゆっくりと合成カラムに押し戻し、カラムに気泡がないことを確認します。混合または攪拌するには、廃シリンジで溶液をカラム上で静かに上下に引っ張ります。カラムから試薬または溶媒を除去するには、溶液をゆっくりと廃シリンジに引き込みます。
溶液の大部分が廃シリンジに渡されたら、アルゴンを通してカラムから残りの溶媒を洗い流します。次に、廃シリンジ接合部の周囲のワックスシールフィルムを除去する。その後、シリンジを取り外し、廃液を捨てる。
その後、廃棄物シリンジを新しいドライシリンジと交換し、ジョイントを再シールします。三リン酸化装置を組み立てた後、前に実証したように200マイクロリットルのピリジンジオキサンを抗チャンバーに添加することによって三リン酸化反応を開始する。しかし、まだ合成カラムにサンプルを引っ張らないでください。
原稿に記載されているようにSalPClをジオキサンに溶解した後、それを抗チャンバーに加え、乾燥シリンジを用いて合成カラムにロードした。その後、15分間反応させ、前述のように廃シリンジを使用してSalPCl溶液を取り出して廃棄します。SalPCl溶液を除去した直後に、250マイクロリットルのTBAP溶液を抗チャンバーに加え、合成カラムにロードした。
前述のように攪拌して20分間反応させ、廃棄します。その後、カラムを0.5ミリリットルのN,N-ジメチルホルムアミド、次いで0.5ミリリットルのアセトニトリルで洗浄し、各添加後に溶媒を除去した。酸化剤溶液を加えた後、それを除去し、図示と同じ手順を用いてカラムをアセトニトリルで再度洗浄し、装置を分解し、5ミリリットルのアセトニトリルでカラムを洗浄した。
その後、カラムを乾燥させます。固体支持体からトリリン酸化オリゴヌクレオチドを切断し、原稿に記載されているように標準的なプロトコールを使用して脱保護する。次に、乾燥した脱保護オリゴヌクレオチドを尿素ローディングバッファーに溶解し、摂氏80度に加熱し、次いでポリアクリルアミドゲル上にロードし、25〜35ワットで1〜2時間実行する。
ゲル電気泳動の最後に、ゲルプレートを取り出した後、それを分解し、ゲルをポリ塩化ビニルフィルムで包む。次に、254ナノメートルのUV光でバックシャドーイングして製品バンドを特定し、カミソリブレードを使用して主要な製品バンドを切り取ります。切り出したゲルをプラスチックシリンジを通して押し出すか、機械的に押し出して粉砕する。
15ヌクレオチドより短いオリゴヌクレオチドの場合、ゲル体積の3倍のヌクレアーゼ自由水に、攪拌または振とうしながら少なくとも12時間溶出させる。次いで、溶液を0.2マイクロメートルフィルターを取り付けたシリンジに通すことによって固体ゲル片を除去し、凍結乾燥によって濃縮する。濃縮後、使い捨てサイズ排除カラムを使用して残留塩および敬礼を除去し、先に実証したように凍結乾燥によって濃縮する。
原稿に記載されているようにポリメラーゼリボザイムとL-RNAプライマー鋳型と三リン酸トリヌクレオチドを含むRNA溶液を10マイクロリットル調製した後、PCRサーモサイクラーで1分間90°Cに加熱し、毎秒0.2°Cで23°Cに冷却してアニールする。RNA溶液を摂氏17度でインキュベートした後、反応が進行するにつれて開始緩衝液の2倍の濃度の10マイクロリットルを加えて反応を停止し、10マイクロリットルのアリコートを取り、pH8で5マイクロリットルの0.5モルEDTAでクエンチし、各サンプルを処理してRNAを単離する原稿に記載されているように。沈殿したRNAを10マイクロリットルのホルマリゼーションゲルローディングバッファーに溶解し、本文に記載されているように未反応末端標識プライマーを調製した。
サンプルの準備ができたら、摂氏80度に加熱します。各ウェルに5マイクロリットルのサンプルをロードし、ゲルを40ワットで約40分間実行します。ゲルプレートをスタンドから取り出した後、蛍光または燐光ゲルスキャナーを使用してスキャンし、交差キラルL-RNA伸長産物を視覚化します。
ゲル精製後、UVバックシャドーイングは、AAAおよびCCC DNA三量体およびGAA L-RNA三量体について示されるように、単一の主要生成物としての5'三リン酸の存在を明らかにする。5'ヒドロキシル側生成物は、しばしばより遅い遊走バンドとして見え、DNA三量体の質量分析によって単離され同定された。ゲル精製中の追加のバンドは、未精製反応生成物の質量分析において、5'二リン酸、一リン酸、およびH-ホスホネート副生成物と相関する。
5'三リン酸生成物は、5'ジおよび一リン酸塊と共に5'三リン酸に対応する一次質量ピークを示す。化学的に三リン酸関連L-RNAトリヌクレオチドを、PAGEで分析したRNA重合反応においてL-RNAプライマーおよびL-RNAテンプレートと共に使用し、蛍光ゲルスキャナーを用いて画像化した。黒丸でマークされた拡張生成物は、テンプレートによってコードされたハンマーヘッドリボザイムのL-RNAバージョンの合成を実証した。
三リン酸化中に水にさらされると、収率が低下します。乾燥試薬を調製し、反応装置を慎重に組み立てるための手順に従ってください。シールの破損を避けるために、装置内の流体をゆっくりと移動させます。
化学的三リン酸化は、左利きRNAを含む非生物学的オリゴヌクレオチド三リン酸を調製するために不可欠である。これにより、生物学に見られるRNA分子の鏡像バージョンのクロスキラルリボザイム合成が可能になりました。
