Le informazioni strutturali su come gli enzimi di riparazione dell'escissione di base rimuovono le lesioni del DNA nel contesto della cromatina sono state scarse. Ciò costituisce una lacuna significativa nella nostra comprensione dei meccanismi coinvolti nell'eziologia delle malattie umane. Il vantaggio principale del nostro protocollo è che abbiamo ottimizzato la preparazione dei campioni utilizzando attrezzature di laboratorio standard.
Ciò consentirà ad altri biochimici del settore di integrare il loro lavoro biochimico con studi crio-EM tecnicamente fattibili. Il nostro protocollo può inoltre essere utilizzato per studiare come altri fattori, inclusi i fattori di trascrizione pionieristici, coinvolgono il nucleosoma. Si tratta di un settore in cui anche le informazioni strutturali sono state limitate.
L'ottimizzazione della preparazione del campione prima di passare alle condizioni di congelamento è stata la chiave per far avanzare il nostro progetto, e questo è meglio farlo con saggi biochimici standard nella progettazione del substrato, nel legame e nelle condizioni di reticolazione. Per iniziare, incubare l'NCP e il fattore di riparazione del DNA di interesse sul ghiaccio per 15 minuti utilizzando un tampone ottimale per il complesso specifico. Quindi, aggiungere glutaraldeide a una concentrazione finale dello 0,005%Dopo aver mescolato bene, incubare a temperatura ambiente per 13 minuti.
Quench con un molare Tris-CL ad una concentrazione finale di 20 millimolari Tris-CL con pH 7,5. Quindi, concentrare a circa 50 microlitri e sostituire il tampone con tampone di congelamento utilizzando una colonna di dissalazione. Successivamente, determinare le assorbanze a densità ottica 280 e 260 nanometri e concentrarsi ulteriormente, se necessario, per raggiungere da 1,3 a 3 milligrammi per millilitro in base alla densità ottica 280 nanometri.
Dopo aver preparato il pulsante di dialisi, posizionare il pulsante contenente il campione sopra un letto di glicole polietilenico con la membrana rivolta verso il basso. Per eseguire la purificazione mediante cromatografia di esclusione dimensionale, lavare ed equilibrare una colonna di esclusione dimensionale con 60 millilitri di acqua distillata, seguita da 80 millilitri di tampone di congelamento durante la notte ad una velocità di 0,4 millilitri al minuto. Quindi, analizzare immediatamente le frazioni di picco e concentrare quelle contenenti la proteina di infusione dell'istone MBP-PolBeta-APE1.
A dimostrare le seguenti procedure sarà Elizabeth Viverette, una tirocinante post-diploma di maturità dal nucleo crio-EM qui in NIH. Dopo aver acceso il congelatore e riempito l'umidificatore con 50 millilitri di acqua distillata, impostare la temperatura della camera a 22 gradi Celsius e l'umidità al 98%Quindi posizionare la tazza di etano e la tazza di azoto liquido nei rispettivi supporti spaziali. Successivamente, coprire la tazza di etano con il distributore del coperchio di etano e versare con attenzione azoto liquido su di essa mentre si riempie anche la tazza di azoto con azoto liquido.
Quando il livello di azoto liquido si è stabilizzato e raggiunge il 100% e la temperatura raggiunge meno 180 gradi Celsius, aprire con attenzione la valvola dell'etano e riempire la tazza di etano fino a formare una bolla sul coperchio trasparente. Quindi rimuovere il distributore di etano. Posizionare due carte da filtro sul dispositivo assorbente e fissarle con un anello metallico.
Vai al setup e imposta i parametri di blotting come descritto nel manoscritto, quindi seleziona A-Plunge e fai clic su OK. Nella schermata principale, fai clic su Carica pinze e caricale con una griglia con il lato dell'applicazione del carbonio rivolto verso sinistra. Calibrare la pinza, regolando l'asse Z per garantire una macchia solida. Fare clic su Camera inferiore e applicare tre microlitri del complesso.
Quindi fare clic su Blot A-Plunge, che ruoterà la griglia per macchiarla dalla parte anteriore e la congelerà. Dopo il trasferimento, conservare la griglia nella scatola della griglia nella camera di azoto liquido. Quando tutte e quattro le griglie sono state congelate e posizionate nella scatola della griglia, ruotare il coperchio in posizione neutra in cui tutte le griglie sono coperte dal coperchio e serrare la vite.
Prima di caricare i campioni nel microscopio, posizionare le griglie vetrificate su un anello e fissarlo utilizzando una clip a C sotto azoto liquido in una stanza con umidità controllata per evitare la contaminazione da ghiaccio. Quando si carica il microscopio, inserire le griglie in una cassetta a 12 slot. Mescolare la cassetta in una capsula nanocab e caricarla nel caricatore automatico.
Quindi, trasferire la griglia dalla cassetta allo stadio del microscopio. Regolare lo stadio all'altezza eucentrica oscillando lo stadio di 10 gradi e contemporaneamente spostando l'altezza Z fino a quando non si osserva uno spostamento planare minimo nelle immagini. Una volta raggiunta l'altezza eucentrica, inizia a scattare l'immagine scattando un'immagine di montaggio 3 per 3 della griglia in cui ogni montaggio viene effettuato con un ingrandimento di 62x per ottenere l'atlante.
Dopo aver scelto tre quadrati di varie dimensioni e aver preso l'altezza eucentrica, immagine con ingrandimento 210x. Una volta creata l'immagine di un quadrato, scegliete un foro ciascuno dal bordo, dal centro e tra i quadrati. Quindi, immagina ogni foro con un ingrandimento di 2.600x.
Prendi l'immagine ad alto ingrandimento dal centro del foro con un ingrandimento di 36.000x e un tempo di esposizione di 7,1 secondi, 60 fotogrammi, dimensioni di 1,18 pixel e sfocatura di tre micrometri. Vedi immagini rappresentative dello screening. Per determinare il rapporto tra NCP e MBP-PolBeta-APE1 per formare un complesso stabile, sono stati eseguiti saggi di spostamento della mobilità elettroforetica, che hanno mostrato una banda singolarmente spostata del NCP con un eccesso molare di cinque volte di MBP-PolBeta-APE1.
In volumi più piccoli, l'assemblaggio del complesso di NCP-PolBeta-APE1 ha dimostrato che il campione era eccessivamente reticolato e risultava in aggregati senza complessi individuali distinguibili. Tuttavia, la diluizione di dieci volte negli NCP ha comportato una significativa riduzione dell'aggregazione e una migliore stabilità delle particelle. I metodi di esclusione del gel preparativo e delle dimensioni possono essere combinati quando il gel preparativo migliora la qualità dei PCN quando contengono una quantità significativa di aggregati ad alto peso molecolare, seguiti dalla purificazione del complesso tramite esclusione dimensionale.
I risultati mostrano che entrambi i metodi possono essere utilizzati indipendentemente per generare complessi stabili. Inoltre, i dati raccolti da entrambe le griglie mostrano classi bidimensionali quasi identiche e mappe tridimensionali con una risoluzione di circa 3,2 angstrom. Un rapporto ottimale tra NCP e fattore di riparazione del DNA dovrebbe essere determinato prima, quindi la reticolazione del complesso con glutaraldeide deve essere eseguita almeno 10 volte più diluita della concentrazione necessaria per il congelamento.
Dopo aver ottenuto una mappa 3D crio-EM del complesso, sarà necessario un ulteriore perfezionamento strutturale per determinare come viene trovato il fattore di riparazione del DNA e identificare quali regioni sono importanti per queste interazioni.
