Trasdurre timociti immaturi con vettori retrovirali e coltivare queste cellule su cellule stromali OP9 DL4 è una tecnica impegnativa. Questo protocollo dettagliato farà risparmiare tempo e fatica ai ricercatori, ottimizzando al contempo questi sistemi. Questa tecnica fornisce un sistema flessibile in vitro per studiare gli effetti delle modificazioni genetiche sulle cellule T immature e può essere utile per studiare lo sviluppo delle cellule T e il cancro.
A dimostrare la procedura sarà Gisele Rodrigues, una borsista post-dottorato del mio laboratorio. Per iniziare, seminare le cellule produttrici di retrovirus da 18 a 24 ore prima della trasfezione al 70-90% di confluenza in ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale a sei pozzetti contenente due millilitri di cellula produttrice di retrovirus o mezzo RPC. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.
Per trasfettare le cellule, sostituire il mezzo con un mezzo RPC fresco un'ora prima della trasfezione. Preparare miscele di lipofezione diluendo quattro microgrammi di DNA contenenti due microgrammi di plasmide helper pCL-Eco e due microgrammi di plasmide di trasferimento pMIG in 250 microlitri di terreno sierico ridotto e mescolare delicatamente. Quindi, mescolare 10 microlitri di reagente di trasfezione e 250 microlitri di mezzo sierico ridotto e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente.
Dopo cinque minuti di incubazione, combinare il DNA diluito con il reagente di trasfezione diluito. Mescolare delicatamente e incubare per 20-25 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere delicatamente i 500 microlitri della miscela di DNA e reagenti di trasfezione al pozzetto contenente le cellule produttrici di retrovirus facendole cadere sulle cellule con un movimento circolare.
Mescolare delicatamente facendo oscillare la piastra avanti e indietro e quindi incubare la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per 16-24 ore. Circa 16 ore dopo la trasfezione, sostituire il vecchio mezzo con due millilitri di terreno RPC fresco e continuare a incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 20-24 ore. Per preparare la sospensione monocellulare di timociti, posizionare un timo raccolto da topi eutanasizzati in cinque millilitri di PBS in una capsula di Petri.
Utilizzando vetrini sterili, posizionare il timo tra le superfici smerigliate dei vetrini e strofinare delicatamente i vetrini insieme, facendo rotolare il timo tra i due vetrini. Risciacquare i vetrini per raccogliere le cellule e scartare il tessuto stromale timico residuo. Filtrare cinque millilitri della sospensione timica attraverso un filtro a filtro cellulare da 30 o 40 micrometri e centrifugare le celle a 300 G per 10 minuti.
Dopo aver rimosso il surnatante, lisare i globuli rossi aggiungendo un millilitro di un tampone di lisi ACK per tubo per un minuto. Aggiungere cinque millilitri di tampone di deplezione cellulare per disattivare il tampone di lisi ACK, centrifugare la sospensione a 300 G per 10 minuti e risospendere da uno a cinque millilitri di tampone di deplezione cellulare per il conteggio. Dopo aver contato le cellule e centrifugato a 300 G per 10 minuti, risospendere le cellule in una volta da 10 al settimo in 80 microlitri di tampone di deplezione cellulare.
Aggiungere 10 microlitri ciascuno di microsfere CD4 e CD8 per una volta 10 alle settima celle. Mescolare bene e incubare per 15 minuti al buio in frigorifero. Quindi, preparare una colonna di esaurimento sciacquandola con due millilitri di tampone di esaurimento e scartando il flusso attraverso.
Lavare le cellule incubate aggiungendo da uno a due millilitri di tampone di esaurimento per una volta 10 le sette cellule. Centrifugare a 300 g per 10 minuti ed eliminare il surnatante. Quindi, applicare la sospensione cellulare risospesa alla colonna e raccogliere il flusso attraverso le celle non etichettate.
Lavare la colonna due volte con un millilitro di tampone e raccogliere il flusso attraverso. Colorare i controlli dell'efficienza di esaurimento dividendo i 200 microlitri di cellule raccolte prima dell'esaurimento in quattro tubi FACS, non colorati, CD4 monocolorati, CD8 monocolorati e CD4 e CD8 a doppia colorazione. Utilizzare i campioni non colorati e monocromatici per impostare i parametri di citometria a flusso.
Utilizzare i 1.000 microlitri di cellule raccolte dopo l'esaurimento per colorare CD4 e CD8 e confrontarli con il campione a doppia colorazione raccolto prima dell'esaurimento. Per coltivare i timociti, posizionare da due a cinque volte da 10 a quinta a una volta da 10 a sesti timociti post-esaurimento in un pallone T25 di cellule OP9 DL4 confluenti dall'80 al 90% in mezzo OP9 contenente citochine. Incubare la coltura a 37 gradi Celsius e 5% anidride carbonica per 24 ore su cellule OP9 DL4.
Per raccogliere il retrovirus, raccogliere il surnatante contenente i retrovirus dalle cellule transettate inclinando la piastra a sei pozzetti e quindi posizionando una siringa da tre a cinque millilitri sul fondo della piastra mentre si tira lo stantuffo per aspirare il surnatante. Filtrare il surnatante retrovirus attraverso un filtro a siringa da 0,45 micrometri e raccogliere il filtrato in un tubo da 50 millilitri. Sostituire il terreno con due millilitri di terreno RPC fresco e continuare a incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 20-24 ore per la seconda trasduzione.
raccogliere i timociti dalla coltura OP9 DL4 mediante pipettaggio aggressivo per rimuovere i timociti e le cellule OP9 DL4 dalla superficie del pallone. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri per rimuovere la maggior parte delle cellule OP9 DL4 e raccogliere il filtrato in un tubo da 50 millilitri. Centrifugare i timociti e il filtrato a 300 G per cinque minuti ed eliminare il surnatante.
Risospendere i timociti in 0,5 a un millilitro di mezzo OP9 con citochine. Aggiungere uno o due millilitri di mezzo RPC contenente il virus. Quindi, aggiungere bromuro di esametrina a otto microgrammi per millilitro di sospensione cellulare totale.
Spinoculate il contenuto centrifugando le cellule a 850 G per un'ora a temperatura ambiente. Risospendere le cellule in sei millilitri di terreno OP9 con citochine per pallone e aggiungere nuovamente la sospensione sul monostrato di cellule OP9 DL4. Incubare a 37 gradi Celsius durante la notte.
Ripetere i passaggi della raccolta del retrovirus utilizzando un nuovo pozzetto del supernatante cellulare contenente retrovirus. Mantenere i timociti trasdotti sulla coltura OP9 DL4 da due a cinque giorni o congelare secondo necessità. L'efficienza di deplezione è stata valutata citometricamente il flusso marcando la frazione cellulare magneticamente non marcata per CD4 e CD8 dopo la separazione cellulare immunomagnetica e analizzandola su un grafico a punti bivariante bidimensionale.
Una buona resa di cellule doppie negative per CD4 e CD8 è del 95% o superiore, come rappresentato qui. Quando si utilizzano vettori che esprimono marcatori schermabili come un gene di fluorescenza, la transezione e la trasduzione possono essere valutate approssimativamente ed empiricamente mediante microscopia a fluorescenza. L'efficienza di trasduzione è stata analizzata raccogliendo i timociti dal monostrato OP9 DL4.
e osservando l'espressione di un gene di fluorescenza mediante citometria a flusso. L'efficienza della trasduzione utilizzando un vettore retrovirale vuoto con GFP poiché il gene reporter era dell'84,2% di differenziazione delle cellule T sulle cellule OP9 DL4 è stata osservata quattro giorni dopo la trasduzione. Analisi citometrica a flusso del differenziamento cellulare indotto dalla co-coltura su cellule OP9 DL4 e dall'espressione del transgene, dove le cellule sono state marcate per CD4, CD8, CD44 e CD 25.
La trasduzione dei timociti doppi negativi con il vettore retrovirale vuoto pMIG presentava approssimativamente le stesse proporzioni di singoli positivi, doppi positivi, doppi negativi, e i suoi sottostadi doppi negativi da uno a quattro dei timociti non trasdotti, indicando che lo sviluppo delle cellule T non era influenzato dal processo di trasduzione. Il compito più difficile quando si tenta di replicare questo protocollo è assicurarsi che i diversi tipi di cellule siano gestiti contemporaneamente in modo coordinato. La sovraespressione di oncogeni nei timociti immaturi occasionalmente può influenzare il normale sviluppo delle cellule T, quindi la successiva immunofenotipizzazione mediante citometria a flusso è un modo utile per imparare quale direzione prendere.
Il potenziale oncogeno delle cellule T trasdotte differenziate sulle cellule dello strato fetale può essere ulteriormente studiato mediante iniezione in topi immunocompromessi.
