Questo metodo mira a dimostrare una tecnica semplice per l'estrazione delle proteine, utile per l'ottenimento di proteine abbondanti e altri fattori. Questa tecnica potrebbe essere utilizzata per estrarre altri fattori e proteine presenti nella membrana amniotica e anche, per ottenere proteine da altre fonti come animali e tessuti vegetali. Inizia scongelando 100 milligrammi della membrana amniotica ottenuta dalla banca dell'amnione.
Una volta scongelato, aggiungere 10 millilitri della soluzione salina bilanciata sterile in una capsula di Petri e lavare la membrana per due minuti. Quindi, rimuovere la soluzione salina bilanciata utilizzata in un becher e ripetere il processo fino a quando nessuna traccia di mezzo glicerolo è visibile nella capsula di Petri. Quindi, aggiungere 10 millilitri di dispasi II alla membrana e incubare a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 30 minuti.
Alla fine dell'incubazione, eseguire una deepitelizzazione meccanica con un raschietto cellulare poliziotto di gomma. Quindi, visualizzare la membrana al microscopio invertito per confermare la deepitelizzazione. Quindi, lavare la membrana amniotica deepitelializzata con la soluzione salina bilanciata sterile come dimostrato in precedenza e metterla in una provetta da microcentrifuga da due millilitri.
Quindi, immergere il tubo contenente la membrana in azoto liquido per 40 minuti. Dopo il congelamento con azoto liquido, macinare manualmente la membrana per due o tre minuti in un mortaio, pre-raffreddato a meno 85 gradi Celsius, fino ad ottenere una polvere fine. Quindi, aggiungere 2,5 millilitri di soluzione di inibitore della proteasi e solubilizzare la membrana finemente in polvere.
Pulire le pareti della malta con l'aiuto di un coltello da bisturi e trasferire la miscela in un tubo da cinque millilitri. Vortice il tubo per 30 secondi. Quindi, omogeneizzare la miscela di tessuto centrifugando prima a 34 G per 20 minuti a quattro gradi Celsius e immediatamente centrifugandola nuovamente a 3.360 G per 20 minuti a quattro gradi Celsius.
Al termine della centrifugazione, raccogliere il surnatante, che è l'estratto della membrana amniotica, in una nuova provetta. Quindi, aliquota 0,7 millilitri in un diverso tubo di microcentrifuga da due millilitri per vari punti temporali e temperature. La quantità totale di proteine e la concentrazione di lumican nell'estratto della membrana amniotica sono state influenzate dal tempo e dalle condizioni di conservazione.
La concentrazione di proteine basali era simile tra tutti gli estratti di membrana amniotica. Tuttavia, una concentrazione proteica significativamente elevata è stata notata nell'estratto conservato per 32 giorni a quattro gradi Celsius e 20 giorni a meno 20 gradi Celsius. Lumican nell'estratto della membrana amniotica era significativamente più alto nel campione conservato per un periodo di 12 giorni rispetto ai campioni conservati per 30, 20 e sei giorni a quattro e meno 20 gradi Celsius.
Questi risultati hanno suggerito che il tempo e la temperatura di conservazione appropriati per ottenere la massima concentrazione di lumican sono di 12 giorni a meno 20 gradi Celsius. Esercitare la massima cura durante la messa a terra della membrana amniotica congelata. La messa a terra dovrebbe essere delicata in quanto potrebbe cadere dalla malta.
Sono necessari ulteriori studi per determinare il ruolo dell'estratto di membrana amniotica lumican nelle cellule epiteliali corneali e per determinare la dose ideale di lumican per la riepitelizzazione corneale.
