Questo studio dimostra che l'ecografia guidata manuale è adatta per monitorare lo sviluppo della patologia uterina in un modello murino indotto di cancro dell'endometrio. L'imaging ad ultrasuoni non è invasivo e quindi consente studi longitudinali di singoli topi per giorni e settimane. Ciò consente la cattura delle variazioni individuali e, in definitiva, un minor numero di animali da utilizzare per lo studio.
Questo metodo può essere facilmente applicato per monitorare i cambiamenti patologici e altri modelli di mirroring, compresi quelli per neoplasie e malattie croniche del tratto urinario e digestivo. Iniziare a configurare la macchina ad ultrasuoni per l'imaging dell'utero o dell'ovaio selezionando un trasduttore o una sonda con un intervallo da 32 a 56 megahertz. Vai alla scheda Applicazioni dalla schermata principale e seleziona Mouse Small Abdomen Mode.
Quindi fare clic su Scansione per tornare alla schermata iniziale e attendere che venga visualizzata un'immagine live. Quindi, selezionare Modalità B dalle opzioni sulla barra degli strumenti di sinistra prima di fare clic sull'opzione Altri controlli per visualizzare strumenti aggiuntivi per il perfezionamento dell'immagine, come il guadagno e la profondità dell'immagine o per regolare le impostazioni di acquisizione della clip, come il numero di fotogrammi al secondo. Una volta selezionate le impostazioni dell'immagine, tornare alla schermata iniziale facendo clic su Modalità B.
Posizionare una siringa da tre a 10 millilitri riempita con una soluzione di liquido isotonico sterile tra una piastra riscaldante e una piastra assorbente per diversi minuti per preriscaldarla a 35-40 gradi Celsius. Se la macchina non ha uno scaldavivande, posizionare una bottiglia di gel per ultrasuoni sulla piastra riscaldante. Per iniettare da uno a due millilitri di soluzione nella cavità peritoneale di un topo, fissare il topo per la collottola in una mano, esponendo lo sventro.
Quindi tenere il mouse con un angolo di circa 20 gradi con il naso puntato verso il pavimento. Inserire un ago da siringa per tubercolina calibro 25 attraverso la pelle e la parete addominale del quadrante caudale destro dell'addome. Per evitare l'iniezione nel sistema vascolare o nel tratto gastrointestinale, tirare indietro lo stantuffo della siringa con una pressione minima per cercare sangue.
Posizionare il topo in posizione ventrale sdraiata sul tampone assorbente sopra una piastra riscaldante prima di posizionare saldamente un cono del naso del roditore sul naso e sul muso del topo. Posizionare una piccola quantità di gel abassiale ad ultrasuoni preriscaldato sulla colonna vertebrale su entrambi i lati del topo anestetizzato tra l'ultima costola e il bacino. Metti una piccola quantità di gel sulla sonda ad ultrasuoni.
Quindi, posizionare la sonda parallelamente alle vertebre con la parte anteriore della sonda sul lato cranico. Con un topo in posizione sdraiata ventrale, scansionare lentamente l'area per il punto di riferimento del rene. Con il rene in vista, tirare la sonda caudale per trovare l'ovaio, che è una struttura ovale o rotonda leggermente iperecogena all'interno di un cuscinetto adiposo ovarico molto iperecogeno, delimitato cranialmente-ventralmente dal rene e dorsale-lateralmente dalla parete addominale dorsale.
Migliora il contrasto dell'immagine regolando il guadagno del segnale utilizzando il cursore nella parte inferiore dello schermo di controllo. Per migliorare l'imaging del rene, applicare pressione sull'addome controlaterale usando un dito. Variare la pressione e l'angolo da parallelo alla colonna vertebrale a circa 20 gradi ventrale.
Una volta che l'organo di interesse è in vista, cattura un video facendo clic su Salva clip o Avvia registrazione. Una volta fatto, fai clic su Interrompi registrazione per conservare le immagini a un numero preimpostato di fotogrammi. Tenere la sonda caudalmente fino a quando l'ovaio è nell'aspetto più cranico del campo visivo.
Variare la pressione e l'angolo della sonda per visualizzare e visualizzare l'utero. Ripeti la raccolta di video e fotogrammi per ogni organo di interesse. Trova l'utero che corre longitudinalmente lungo la parete addominale dorsale con la muscolatura laterale della gamba in vista.
Monitorare il tessuto per un movimento peristaltico per differenziare le anse intestinali dalle corna stazionarie uterine. Posizionare il mouse in posizione dorsale sdraiata per raccogliere le immagini da un approccio ventrale. Assicurarsi che la lubrificazione degli occhi sia sufficiente e che la museruola sia fissata nel cono del naso.
Applicare una piccola quantità di gel ecografico preriscaldato sull'addome ventrale prima di applicare la sonda sulla linea mediana e cranica del pube per individuare la vescica come punto di riferimento ipoecogeno. Per trovare le corna uterine, tirare la sonda lateralmente alla vescica. Applicare una leggera pressione digitale da uno o entrambi i lati del mouse.
Una volta che le corna uterine sono nel campo visivo, tenere la sonda perpendicolare al mouse e scansionare entrambi i lati dell'addome per catturare le viste trasversali di entrambe le corna. Ruotare la sonda per acquisire viste sagittali. Dopo l'ecografia, pulire il mouse con un tovagliolo di carta prima di rimetterlo nella sua gabbia per recuperare.
Una volta che il topo è completamente sveglio dopo due-cinque minuti, riporta il topo nella stanza degli animali. Il confronto delle immagini ecografiche della cavità addominale del topo prima e dopo l'iniezione salina ha mostrato una migliore visualizzazione degli organi addominali, compresi l'utero e le ovaie dopo l'iniezione salina. Un approccio ventrale è stato utilizzato per studiare le sezioni trasversali delle corna uterine adiacenti alla vescica ipoecogena.
L'immunoistochimica con anticorpi diretti contro Arid1a e Pten è stata utilizzata per studiare l'adeguata perdita di proteine oncosoppressori compiuta nelle cellule epiteliali uterine rispetto al tessuto stromale vicino. Le immagini ecografiche di un utero di topo con alterazioni patologiche precoci sono state rilevate dopo tre settimane di trattamento con doxiciclina, mostrando il lume ipoecogeno e dilatato dell'utero. Nello studio di patologia grossolana e istopatologia dello stesso utero, sono stati osservati rispettivamente un utero a parete sottile più piccolo ma dilatato e un'iperplasia endometriale precoce con la conservazione del lume distinto.
I topi eutanasizzati, in momenti successivi, hanno mostrato un utero più grande con un lume più piccolo e una parete ispessita. Quando si impara a utilizzare il posizionamento manuale delle sonde, una pressione eccessiva o un movimento rapido possono rendere difficile l'identificazione degli organi. Usa movimenti delicati e deliberati e concentrati sull'identificazione degli organi che sono punti di riferimento per primi.
All'endpoint dello studio, i topi vengono sacrificati e il tessuto viene raccolto per confermare il knockdown genico e caratterizzare i cambiamenti tissutali. Questa tecnica consente ai ricercatori di monitorare le lesioni intraaddominali nel tempo. E nel nostro caso, lo abbiamo usato per monitorare la progressione del cancro uterino nel modello iPad, che abbiamo poi confermato dall'istopatologia.
