Este estudo mostra que a ultrassonografia guiada manualmente é adequada para monitorar o desenvolvimento de patologia uterina em um modelo induzido de câncer de endométrio em camundongos. A imagem de ultrassom não é invasiva e, portanto, permite estudos longitudinais de camundongos individuais ao longo de dias e semanas. Isso permite a captura da variação individual e, finalmente, que menos animais sejam usados para estudo.
Este método pode ser prontamente aplicado para monitorar alterações patológicas e outros modelos de espelhamento, incluindo aqueles para neoplasias e doenças crônicas do trato urinário e digestivo. Comece a configurar o aparelho de ultrassom para obter imagens do útero ou ovário selecionando um transdutor ou sonda com um intervalo de 32 a 56 mega-hertz. Vá para a guia Aplicativos na tela inicial e selecione Modo de abdômen pequeno do mouse.
Em seguida, clique em Digitalizar para retornar à tela inicial e aguarde até que uma imagem ao vivo seja exibida. Em seguida, selecione Modo B nas opções na barra de ferramentas esquerda antes de clicar na opção Mais controles para exibir ferramentas adicionais para refinamento de imagem, como ganho e profundidade de imagem, ou para ajustar as configurações de aquisição de clipe, como o número de quadros por segundo. Quando as configurações de imagem estiverem selecionadas, retorne à tela inicial clicando em Modo B.
Coloque uma seringa de três a 10 mililitros preenchida com uma solução de fluido isotônico estéril entre uma almofada de aquecimento e uma almofada absorvente por vários minutos para pré-aquecê-la a 35 a 40 graus Celsius. Se a máquina não tiver um aquecedor, coloque um frasco de gel de ultrassom na almofada de aquecimento. Para injetar um a dois mililitros de solução na cavidade peritoneal de um rato, prenda o rato pelo scruff numa mão, expondo o ventrum.
Em seguida, segure o mouse em um ângulo de aproximadamente 20 graus com o nariz apontado para o chão. Insira uma agulha de seringa tuberculínica de calibre 25 através da pele e da parede abdominal do quadrante direito caudal do abdome. Para evitar a injeção na vasculatura ou no trato gastrointestinal, puxe o êmbolo da seringa com pressão mínima para procurar sangue.
Posicione o rato em decúbito ventral sobre a almofada absorvente sobre uma almofada de aquecimento antes de colocar com segurança um cone nasal de roedor sobre o nariz e o focinho do rato. Coloque uma pequena quantidade de gel de ultrassom pré-aquecido abaxial na coluna vertebral de cada lado do camundongo anestesiado entre a última costela e a pelve. Coloque uma pequena quantidade de gel na sonda de ultrassom.
Em seguida, coloque a sonda paralela às vértebras com a frente da sonda no lado cranial. Com um rato em decúbito ventral, escaneie lentamente a área em busca do ponto de referência renal. Com o rim em vista, puxe a sonda caudal para encontrar o ovário, que é uma estrutura oval a redonda levemente hiperecoica dentro de um coxim adiposo ovariano muito hiperecoico, limitado crânio-ventralmente pelo rim e dorsolateralmente pela parede abdominal dorsal.
Melhore o contraste da imagem ajustando o ganho de sinal usando o controle deslizante na parte inferior da tela de controle. Para melhorar a imagem do rim, aplique pressão no abdome contralateral usando um dedo. Varie a pressão e o ângulo de paralelo à coluna vertebral para aproximadamente 20 graus ventrais.
Quando o órgão de interesse estiver à vista, capture um vídeo clicando em Salvar Clipe ou Iniciar Gravação. Uma vez feito, clique em Parar gravação para reter imagens em um número predefinido de quadros. Segure a sonda caudalmente até que o ovário esteja no aspecto mais cranial do campo de visão.
Varie a pressão e o ângulo da sonda para visualizar e fotografar o útero. Repita a coleta de vídeos e quadros para cada órgão de interesse. Encontre o útero correndo longitudinalmente ao longo da parede abdominal dorsal com a musculatura lateral da perna em vista.
Monitorar o tecido para um movimento peristáltico para diferenciar as alças intestinais dos cornos estacionários uterinos. Coloque o mouse em decúbito dorsal para coletar as imagens a partir de uma abordagem ventral. Certifique-se de que a lubrificação ocular é suficiente e que o focinho está preso no cone do nariz.
Aplicar uma pequena quantidade de gel de ultrassom pré-aquecido no abdome ventral antes de aplicar a sonda na linha média e cranial do púbis para localizar a bexiga como um marco hipoecoico. Para encontrar os cornos uterinos, puxe a sonda lateralmente para a bexiga. Aplique uma leve pressão digital de um ou ambos os lados do mouse.
Uma vez que os cornos uterinos estão no campo de visão, segure a sonda perpendicularmente ao mouse e escaneie ambos os lados do abdômen para capturar vistas transversais de ambos os cornos. Gire a sonda para capturar visualizações sagitais. Após o ultrassom, limpe o mouse com um papel toalha antes de devolvê-lo à sua gaiola para se recuperar.
Quando o rato estiver totalmente acordado após dois a cinco minutos, regresse o rato à sala dos animais. A comparação de imagens ultrassonográficas da cavidade abdominal de camundongos antes e após a injeção de solução salina mostrou melhor visualização dos órgãos abdominais, incluindo útero e ovários, após a injeção de soro fisiológico. Uma abordagem ventral foi usada para estudar os cortes transversais dos cornos uterinos adjacentes à bexiga hipoecoica.
A imuno-histoquímica com anticorpos direcionados contra Arid1a e Pten foi utilizada para estudar a adequada perda proteica supressora tumoral realizada nas células epiteliais uterinas em comparação com o tecido estromal vizinho. Imagens de ultrassom de útero de camundongo com alterações patológicas precoces foram detectadas após três semanas de tratamento com doxiciclina, mostrando o lúmen hipoecoico e dilatado do útero. No estudo anatomopatológico e histopatológico do mesmo útero, observou-se útero de paredes finas, menor, mas dilatado, e hiperplasia endometrial precoce, com preservação da luz distinta, respectivamente.
Os camundongos eutanasiados em momentos posteriores mostraram útero maior, com lúmen menor e parede espessada. Ao aprender a usar a colocação manual de sondas, a pressão excessiva ou a movimentação rápida podem dificultar a identificação do órgão. Use movimentos suaves e deliberados e concentre-se em identificar os órgãos que são marcos primeiro.
Ao final do estudo, camundongos são sacrificados e tecido é coletado para confirmar o knockdown genético e caracterizar as alterações teciduais. Essa técnica permite que os investigadores monitorem as lesões intra-abdominais ao longo do tempo. E, no nosso caso, usamos para monitorar a progressão do câncer uterino no modelo iPad, o que confirmamos por histopatologia.
